(2021年整理)總RNA的提取定量與RT-PCR

1、總rna的提取定量與rt-pcr總rna的提取定量與rt-pcr 編輯整理：尊敬的讀者朋友們：這里是精品文檔編輯中心，本文檔內(nèi)容是由我和我的同事精心編輯整理后發(fā)布的，發(fā)布之前我們對文中內(nèi)容進行仔細校對，但是難免會有疏漏的地方，但是任然希望（總rna的提取定量與rt-pcr）的內(nèi)容能夠給您的工作和學習帶來便利。同時也真誠的希望收到您的建議和反饋，這將是我們進步的源泉，前進的動力。本文可編輯可修改，如果覺得對您有幫助請收藏以便隨時查閱，最后祝您生活愉快 業(yè)績進步，以下為總rna的提取定量與rt-pcr的全部內(nèi)容。生物化學實驗報告姓 名： 學 號: 專業(yè)年級: 級臨床八年制 組 別: 第二實驗室 生

2、物化學與分子生物學實驗教學中心實驗名稱（title of experimetn)總rna的提取、定量與rt-pcr實驗日期（date of experiment）11月27日實驗地點(lab no。）第二實驗室合作者(partner）指導老師（instructor)總分(total score）教師簽名(signature）批改日期(date)【預習報告】一、 實驗原理1）總rna的提取與定量在哺乳動物中,平均每個細胞內(nèi)大約含有105g rna,其中rrna占總量的8085%，trna和核內(nèi)小分子rna占10-15%，而mrna只占1-5。rrna由28s、18s、5s等幾類組成，這些rna分

3、子根據(jù)密度和分子大小，通過密度梯度離心、凝膠電泳、離子交換層析進行分離。mrna分子種類繁多，分子量大小不均一，在細胞中含量少，絕大多數(shù)mrna分子(除血紅蛋白、有些組蛋白mrna以外)，在3端存在20-250個多聚腺苷酸(polya)。利用此特點，用oligo(dt）親和層析柱分離mrna. rna分離的方法有：異硫氰酸胍氯化銫超速離心法,鹽酸胍-有機溶劑法，氯化鋰-尿素法,蛋白酶k-細胞質(zhì)rna提取法等、異硫氰酸胍酚-氯仿一步法等。目前常用的是trizol法。 trizol試劑適用于從細胞和組織中快速分離rna.trizol的主要成分是異硫氰酸胍和酚.異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白

4、質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。酚雖可有效的變性蛋白質(zhì)，但是它不能完全抑制rna酶活性，因此trizol中還加入了8羥基喹啉、巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源rnase.在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相,rna選擇性地進入無dna和蛋白質(zhì)的水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收rna；用乙醇沉淀中間層可回收dna；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。 trizol試劑可用于小量樣品（50100mg組織、5106細胞）也適用于大量樣品（1g組織、107細胞）。對人，動物,植物組織，細菌均適用，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成.分離的總rna無蛋白質(zhì)和dna污

5、染,可用于northern blot，dot blot,ploya篩選，體外翻譯，rnase保護分析和分子克隆.在用于rt-pcr時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi)，建議用無rnase的dnase處理rna樣品，避免出現(xiàn)假陽性.共純化的dna可用作標準,比較不同樣品rna的得率，也可用于pcr和酶切。蛋白質(zhì)可用于western blotting。 2）逆轉錄聚合酶鏈反應 （reverse transcriptionpolymerase chain reaction，rt-pcr) 提取組織或細胞中的總rna，以其中的mrna作為模板，采用oligo(dt）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cdn

6、a。再以cdna為模板進行pcr擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。rtpcr使rna檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,使一些極為微量rna樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cdna探針、構建rna高效轉錄系統(tǒng)。 二、 實驗材料1)總rna 的提取1. 紫外分光光度計、微量加樣槍、滅菌超薄pcr反應管 2. trizol試劑 3。 氯仿 4. 異丙醇 5. 75乙醇6。 無rnase的水或0.5sds (溶液均需用depc處理過的水配制) 2）rt-pcr1。 基因擴增儀（如pe geneamp pcr system 2400 或 9700)、微量加樣槍、凝膠

7、成像系統(tǒng)、滅菌超薄pcr反應管 2rna提取試劑 3第一鏈cdna合成試劑盒4dntp mix:含datp、dctp、dgtp、dttp各2 mmol/l5taq dna聚合酶 三、 實驗步驟（一）總rna的提取 1。 勻漿處理： a。組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml trizol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過trizol體積10. b.單層培養(yǎng)細胞 直接在培養(yǎng)板中加入trizol裂解細胞，每10cm2面積加1ml，用移液器吸打幾次。trizol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù).trizol加量不足可能導致提取的rna有dna污染。 c.細胞懸液

8、離心收集細胞，每5-10106動物、植物、酵母細胞或1107細菌細胞加入1ml trizol,反復吸打。加trizol之前不要洗滌細胞以免mrna降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。 (注意：勻漿一定要徹底，是提取高質(zhì)量rna的前提;細胞數(shù)量與trizol的比例，細胞的數(shù)量不能過多.） 2. 將勻漿樣品在室溫（15-30)放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離。 3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉,植物結節(jié)部分等）可于2-8 10000g離心10 min，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖，高分子量dna，上清中含有rna。處理脂肪組織時,上層有大

9、量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。 4。 每使用1ml trizol加入0。2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3 min。 (注意：此步振蕩非常重要，建議在旋渦振蕩器上進行。） 5. 2810000g離心15 min。樣品分為三層：底層為黃色（紅或綠)有機相，上層為無色水相和一個中間層.rna主要在水相中，水相體積約為所用trizol試劑的60。 6. 把水相轉移到新管中（如要分離dna和蛋白質(zhì)可保留有機相),用異丙醇沉淀水相中的rna。每使用1ml trizol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10 min。 7。 2810000g離心10 min，離心前看不出rna沉淀，離心后在管

10、側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀.移去上清。 8。 用75乙醇洗滌rna沉淀.每使用1ml trizol至少加1ml 75乙醇。2-8不超過7500g離心5 min，棄上清。 9. 室溫放置干燥或真空抽干rna沉淀，不要晾得過干，否則不易溶解,大約晾510min。加入25-200l無rnase的水，70保存。 (二)rt-pcr 1。 總rna的提取：見前述內(nèi)容. 2. cdna第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cdna第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一.現(xiàn)以takara公司提供的primescripttm 1st strand cdna synthesis kit試劑盒為例。 （1）在0.2

11、ml微量離心管中，加入以下： 總rna 15 g 、dntp 1 l 、random primer 1 l 、補充適量的depc h2o使總體積達10 l。輕輕混勻、離心。 （2）pcr儀上65加熱5min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。 (3）然后加入下列試劑的混合物： 5primescript buffer 4 l 、rnase inhibator 0.5 l 、rtase 1 l 、rnase free h2o 4。5 l ,輕輕混勻，離心。 （4） 30孵育10 min. （5） 42孵育60 min. (6)于70加熱15 min以終止反應,將管插入冰中。 3pcr：本次實

12、驗采用premix taq version2.0(loading dye mix）試劑 （1）取0.5ml pcr管，依次加入下列試劑：第一鏈cdna 2 l 、上游引物（10pmol/l）2 l 、下游引物（10pmol/l）2 l 、dntp（2mmol/l） 4 l 、10pcr buffer 5 l 、taq酶（2u/l） 1 l 。（2)加入適量的ddh2o,使總體積達50 l。輕輕混勻，離心。 （3）設定pcr程序。在適當?shù)臏囟葏?shù)下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在pcr擴增目的基因時，加入一對內(nèi)參（如g3-pd)的特異性引物，同時擴增內(nèi)參dna，作為對照。

13、 （4）電泳鑒定：進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。 (5）結果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶掃描分析。 四、實驗注意事項1、本實驗大部分為rna操作，注意rna酶的污染。2、快速的操作，低溫環(huán)境，少量取上清 主要是抽提之后吸取上清時要特別小心，只要不把蛋白層吸出來就不會有rnase污染.3、加樣原則是酶最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加?！緦嶒炗涗洝恳弧?實驗條件見第一、第二部分。二、 實驗現(xiàn)象1、 瓊脂糖凝膠電泳圖像:反轉錄dna條帶marker帶從凝膠電泳的圖像上看,本組的反轉錄dna條帶可以看到與marker帶對應的特異性條帶,但特異性不明顯，也出現(xiàn)了彌散或非特異性條帶?！窘Y果與討論】一、結果如上圖所示。三、 討論（1)特異性反