熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中α 突觸核蛋白毒性的作用

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減熱休克蛋白70減輕帕金森病細(xì)胞模型中a突觸核蛋白毒性的作用（作者：?jiǎn)挝唬亨]編：）【摘要】目的探討HSP70在因a-突觸核蛋白過表達(dá)或突 變所致的帕金森病（PD）細(xì)胞模型中的作用及其機(jī)制。方法構(gòu)建過表達(dá) 野生型和PD相關(guān)突變型（A53T） a-突觸核蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì) 胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）細(xì)胞后得PD細(xì)胞模型;然后在細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染 表達(dá)HSP70的質(zhì)粒。采用免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染 HSP70細(xì)胞模型中a- 突觸核蛋白表達(dá)量的改變；采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染HSP70后細(xì)胞模型 活力的變化。結(jié)果轉(zhuǎn)染HSP70后，細(xì)胞模型a-突觸核蛋白表達(dá)減少， 細(xì)胞活性增加。結(jié)

2、論 HSP70通過降低a-突觸核蛋白表達(dá)水平對(duì) PD 細(xì)胞模型發(fā)揮保護(hù)作用。【關(guān)鍵詞】a-突觸核蛋白；熱休克蛋白70;過表達(dá)a-突觸核蛋白是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前表達(dá)的可溶性蛋白，具有調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性和神經(jīng)可塑性等生理功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，a -突觸 核蛋白基因過表達(dá)或突變可引起a -突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊、有毒蛋白 寡聚體和多聚體的形成，使其結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)致多巴胺能系統(tǒng)損傷，最終導(dǎo)致帕金森病(PD)。研究認(rèn)為神經(jīng)保 護(hù)劑可能是治療PD的一個(gè)新的有效途徑，而熱休克蛋白70(HSP70) 就是其中之一。HSP70是分子伴侶家族中的一員，作為一種重要的應(yīng) 激蛋白，能與 錯(cuò)誤折疊的

3、蛋白相互作用，阻止聚集物的形成；除此之外，HSP70還有助于錯(cuò)誤折疊蛋白的降解1, 2。在果蠅及酵母的 PD模型中發(fā)現(xiàn)，HSP70能減輕a-突觸核蛋白的毒性及其引起的神經(jīng) 細(xì)胞凋亡3，4，而HSP70抑制a-突觸核蛋白毒性可能與其能夠與 a-突觸核蛋白相互作用，阻止a -突觸核蛋白纖維樣聚集，降低a -突觸 核蛋白表達(dá)量有關(guān)5, 6。為進(jìn)一步證實(shí) HSP70在a-突觸核蛋白 所致PD的作用，本實(shí)驗(yàn)首次在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 (SH-SY5Y)PD模 型中檢測(cè)了 HSP70的作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn) HSP70可以通過降低a -突 觸核蛋白水平發(fā)揮對(duì)PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料SH-S

4、Y5Y細(xì)胞購(gòu)自ATCC公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自 Takara 公司;QIAprep TIP100 Kit 購(gòu)自 QIAGEN 公司;人胎腦 cDNA 文庫、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司;蛋 白酶抑制劑 cocktail 購(gòu)自 Sigma 公司;anti- a-synuclein 204 抗體、 anti-beta-actin抗體購(gòu)自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu) 自 Millipore 公司。1.2方法1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建以人胎腦cDNA文庫為模板，PCR獲得a-突觸 核蛋白可編碼序列(CDS序列)以Not I和H

5、i nd皿連接到pCDNA3.1真 核表達(dá)載體中，通過overlap PCR方法，構(gòu)建A53T突變體，同樣以 Not I禾和Hi nd皿連接到pCDNA3.1 真核表達(dá)載體中。按照 QIAprep TIP100 Kit Protocol抽取并純化質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)。pCDNA3.1-HSP70 質(zhì)粒由湘雅二醫(yī)院肝移植中心李杰群博士惠贈(zèng)。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%FBS的高糖 DMEM培養(yǎng)液，置于37 C，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照 Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基洗滌 細(xì)胞2次，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入含 2山Lipo

6、fectamine2000及 0.8 質(zhì)粒DNA、不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基500 山在37 C， 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基繼 續(xù)孵育48 h。1.2.3免疫熒光將穩(wěn)定表達(dá)蛋白的SH-SY5Y細(xì)胞接種到有蓋玻 片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)于37C、5% CO2 培養(yǎng)箱中36 h后，棄去培養(yǎng)基，3.7%的多聚甲醛/磷酸緩沖液(PBS) 室溫下固定15 min。PBS 洗 2次，每次 5 min。0.2%的 Trit on X-100/PBS 透化 10 min，PBS 洗 2 次，5% 牛血清白蛋白(BSA) 圭寸閉液，室溫圭寸閉

7、30 min。加入1 400稀釋的anti- a-synuclein204 一抗室溫孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封閉液， 室溫封閉20 min。加入1 ：00稀釋的anti-鼠lgG-Cy2二抗100 “， 避光室溫下孵育60 min。1 XPBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基 -2-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核，室溫，避光反應(yīng) 2 min。 PBS洗2次, 每次5 min。去離子水洗1次，封片，用激光共聚焦顯微鏡掃描和照相。124免疫印跡取細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，加入2X十二烷基硫酸鈉(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCI

8、 , 20% Glycerol , 4% SDS , 0.1% bromphenol blue, pH 6.8)加入蛋白酶抑制劑 cocktail裂解細(xì) 胞，超聲后，使用蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。均取20總蛋白經(jīng)18% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應(yīng)一抗，4 C過夜，Tris緩沖生理鹽 水溶液(TBST)洗膜后，加入對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室 溫孵育60 min，TBST洗膜后，電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ECL)發(fā)光， 曝光。內(nèi)參照為鼠抗-actin單克隆抗體。1.2.5細(xì)胞活力測(cè)定調(diào)節(jié) SH-SY5Y細(xì)胞密度約5X104/ml，

9、以 100 /孔接種于96孔板，24 h后分別轉(zhuǎn)染pCDNA 3.1+HSP70;a-突觸核蛋白野生型+ PCDNA3.1； a-突觸核蛋白野生型+HSP70; a-突 觸核蛋白A53T+PCDNA3.1; a-突觸核蛋白A53T+HSP70;每種處理設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。棄培養(yǎng)基，每孔加二甲基亞砜(DMSO)100 “振蕩混勻，待顆粒 溶解后置于酶標(biāo)儀上，空白孔調(diào)零，以 570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度 值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用t檢驗(yàn)進(jìn) 行兩組間差異比較。2結(jié)果 2.1PD細(xì)胞模型的構(gòu)建a -突

10、觸核蛋白野生型和突變型 A53T在 轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，胞漿和胞核都有分布，以胞漿分布為主，部 分細(xì)胞a-突觸核蛋白呈點(diǎn)狀分布，可能為其聚集體。免疫印跡也顯示， SH-SY5Y細(xì)胞中a-突觸核蛋白野生型和突變型 A53T都得到了過表 達(dá)，說明PD細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖1A、B。2.2HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型中a -突觸核蛋白的影響了探討 HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型中過表達(dá)的a -突觸核蛋白的作用，將 HSP70 與a-突觸核蛋白進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染，通過免疫印跡檢測(cè)HSP70對(duì)a-突觸核蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，無論是在a -突觸核蛋白野生型還是突 變型PD細(xì)胞模型中，HSP70均能降低a-突觸核

11、蛋白的表達(dá)。見圖2。 A:免疫熒光檢測(cè)a -syunclein野生型（左圖）與A53T突變體（右圖）在 SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為 anti a-syunclein 鼠單克隆抗體，二抗 為cy2標(biāo)記的anti mouse IgG 抗體。藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。B: western印跡檢測(cè)a-syunclein在SH-SY5Y中的表達(dá)。一抗為anti a -syunclein 鼠單克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的anti mouse IgG 抗體。 內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白beta act in。圖1 a-syu ncle in過表達(dá)PD模型的 建立 Western印跡檢測(cè)a-syunclein與

12、HSP70共轉(zhuǎn)染后，HSP70對(duì) a-syunclein 野生型和突變性表達(dá)量的影響。一抗為anti a-syunclein 鼠單克隆抗體，antiHSP70單克隆抗體，二抗為 HRP標(biāo)記的anti mouse IgG抗體。內(nèi)參為細(xì)胞骨架蛋白B -actin。圖2HSP70降低a -synuclein的表達(dá)量2.3HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型活力的影響轉(zhuǎn)染野生型和突變體a -突觸核蛋白后，SH-SY5Y細(xì)胞活性明顯降低，說明a -突觸核蛋白對(duì)SH-SY5Y具有毒性作用，PD細(xì)胞模型建立成功。而增加 HSP70的 表達(dá)后，對(duì)比a -突觸核蛋白野生型(asynuclein WT)+ pCDNA3.1組

13、 和a-突觸核蛋白突變型 (a-synucleinA53T)+pCDNA3.1組，表達(dá)HSP70能分別提高a-synuclein WT 和a-synuclein A53T 引起的細(xì)胞 活性降低(P0.01)，見表1。表1MTT檢測(cè)HSP70對(duì)過表達(dá)a-syunclein SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響3討論a-突觸核蛋白是一種分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前末梢，約1520 kD的可溶性蛋白質(zhì)。自然狀態(tài)下呈一種非折疊構(gòu)象，不形成 明顯的三維結(jié)構(gòu)，但其N末端2/3的序列可以形成一系列雙極性區(qū)域， 可能介導(dǎo)其與膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合；當(dāng)高濃度或異常修飾時(shí)，構(gòu)象改變形成 寡聚體甚至是聚集體，具有細(xì)胞毒性7，8。與單體不

14、同，這類寡 聚體富含8片層結(jié)構(gòu)，在原子力顯微鏡及電鏡下，可以觀察到這類寡 聚體形成過程中，一般先呈包含 2030個(gè)a-突觸核蛋白分子的圓狀 結(jié)構(gòu);隨后因彼此聚合形成鏈狀結(jié)構(gòu)，最終轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的纖維狀結(jié)構(gòu)。 這種由單體向纖維狀結(jié)構(gòu)的改變，可能是a-突觸核蛋白產(chǎn)生毒性作用 的重要原因5，10。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與家族性PD有關(guān)的a-突觸 核蛋白A53T及A30P突變蛋白在體外均可以促進(jìn)寡聚體的形成，同時(shí)，野生型a-突觸核蛋白的過量表達(dá)也可以導(dǎo)致寡聚體的增加11， 12。當(dāng)機(jī)體無法處理有毒的a -突觸核蛋白中間體時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致a - 突觸核蛋白形成聚集體，最終導(dǎo)致 PD的發(fā)生11，13，14。分子伴侶作

15、為一類介導(dǎo)協(xié)助蛋白形成與維持天然構(gòu)象的重要細(xì)胞因子，在a突觸核蛋白蛋白結(jié)構(gòu)狀態(tài)轉(zhuǎn)換過程中可能發(fā)揮著很重要 的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)表明，路易小體中除a -突觸核蛋白外，還含有其他 蛋白質(zhì)，而HSP是其中重要的蛋白之一 15。當(dāng)a突觸核蛋白本身 結(jié)構(gòu)的改變或分子伴侶、降解系統(tǒng)出現(xiàn)異常時(shí)，a -突觸核蛋白的毒性 作用就體現(xiàn)出來了。在模型動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，分子伴侶(HSP70、HSP40)的表達(dá)可減輕a-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性。譬如，在 PD果蠅 模型中，HSP70的表達(dá)可以減輕或阻止a -突觸核蛋白引起的神經(jīng)元 損傷;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地減緩或抑制 PD的 發(fā)生3，4。因此，分子伴侶蛋

16、白可能通過協(xié)助a -突觸核蛋白形成 并維持正確構(gòu)象而防止其聚集產(chǎn)生有毒害作用的聚集體。本研究中， 利用a-突觸核蛋白過表達(dá)細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HSP70后能使PD細(xì)胞活性增加，說明HSP70對(duì)PD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。過表達(dá) HSP70后，a-突觸核蛋白的表達(dá)量也降低，而目前已知a -突觸核蛋 白是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要因素11，13，14，因此認(rèn)為HSP70對(duì) PD細(xì)胞模型的保護(hù)作用是通過減少a -突觸核蛋白的表達(dá)量的表達(dá)量 而實(shí)現(xiàn)的。由于a-突觸核蛋白的細(xì)胞毒性作用與其由單體向寡聚體轉(zhuǎn)化有關(guān)9，10，因此推測(cè)，HSP70可能通過參與維持a-突觸 核蛋白的正確構(gòu)象，減少其向有毒的寡聚體和聚集體狀

17、態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 減少細(xì)胞的毒性作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Hartl FU,Hayer-Hartl M.Molecular chaperones in thecytosol : from nascent chainto folded protein J.Scienee，2002;295(5561) : 1852-8.2Dzama n-Serafi nS,Telat yn ska-MieszekB,CiechanowskiK.Heat shock proteins andtheir characteristicsJ.Pol Merkur Lekarski , 2005;19(110):215-9.3Aul

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