分子生物學(xué)：基因工程（研究生）

1、基因工程（genetic engineering） 20世紀(jì)70年代以來，分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)形成了一項 融科研、生產(chǎn)、開發(fā)為一體的新興科技領(lǐng)域-生物技術(shù) （biotechnology), 基因工程 四大工程 細(xì)胞工程 蛋白質(zhì)工程 酶工程 基因工程技術(shù) 兩大技術(shù) 單克隆抗體技術(shù),一、基因工程的定義 基因工程是在分子水平上，用人工方法提取或制備DNA 通過載體 在體外切割、拼接和重新組合 把重組DNA分子導(dǎo)入 受體細(xì)胞 使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制、表達(dá) 生產(chǎn)出人們所需要的產(chǎn)物，或定向創(chuàng)造生物的新性狀，并使 之穩(wěn)定傳給下一代.,基因克隆技術(shù)概論,二、克?。╟lone) 基因工程中 最

2、重要的工作是進(jìn)行分子克隆 (molecular cloning) clone:通過無性繁殖所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體 （ A clone is a large population of identical molecules, bacteria, or cells that arise from a common ancestor.） 來自同一始祖的相同副本或拷貝(copy)的集合.,clone技術(shù)有三個層次 整體水平：克隆羊多莉的出現(xiàn) 細(xì)胞水平：制備單克隆抗體時 分子水平（即分子克?。杭粗苽?DNA片段，通過載體導(dǎo)入受體細(xì) 胞，在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴增，以 獲得單一DNA分子的大量c

3、opy.,我國，上海，TaoTao（牛），它的乳汁中含有人血清白蛋白， 實質(zhì)是乳腺生物發(fā)生器，即把人血清白蛋白基因整合到牛受精卵 染色體與泌乳相關(guān)基因上。再如：牛肉味的番茄 現(xiàn)在，人們將 DNA重組技術(shù) 同義詞無本質(zhì)區(qū)別 基因工程技術(shù) 分子克隆技術(shù),Genetic engineering mice,基因工程之產(chǎn)物-置入生長激素,C. 醫(yī)學(xué)用途(基礎(chǔ)研究),第一節(jié)、工具酶 （Tool Enzyme） 基因工程中許多工作都涉及到對DNA進(jìn)行切割、重 組、修改、合成，這些都是通過酶的作用來完成的。 一、限制酶（restriction enzyme) 1、定義：是一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定堿

4、基 序列的核酸內(nèi)切酶。所謂限制（ restriction ），就 是指切割（cleavage),許多細(xì)菌具有免疫的防衛(wèi)系統(tǒng)，即限制與修飾系統(tǒng)（R-M系 統(tǒng)），該系統(tǒng)對外來非己DNA通過限制作用使其降解，對自己 DNA則加以修飾而不受限制作用的降解 限制：由限制酶來實現(xiàn) 修飾：由甲基化酶實現(xiàn) 2、多數(shù)限制酶是從細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，分為3類 、：同時有限制、修飾功能 ：特異性強、無修飾作用，被譽為分子生物學(xué)家的手術(shù)刀,3、限制酶的命名 第一個字母：該酶的細(xì)菌屬名 第二、三個字母：該酶的細(xì)菌種名，小寫 第四個字母：該酶的株名 4、類限制酶的作用特點： 1）有嚴(yán)格的識別、切割序列，以內(nèi)切的方式水解雙鏈DNA中

5、磷 酸二酯鍵。 2）識別序列通常為4-6 bp的回文結(jié)構(gòu)（palindrome),即180 GGGCCC 旋轉(zhuǎn)對稱的結(jié)構(gòu)。 CCCGGG,3）切割后產(chǎn)生三種不同的切口： A 平頭末端或鈍性末端（blunt end): 在識別序列的對稱軸 上，對雙鏈DNA同時切割。 如： 5-GGCC-3 Hae 5-GG CC-3 + 3-CCGG-5 3-CC GG-5 B 5端突出的粘性末端（cohesive end or sticky end) 在識別序列的兩個對稱點上切開DNA鏈，產(chǎn)生帶單鏈尾巴 的粘性末端。 如：5-GAATTC-3 EcoR 5-G + AATTC-3 3-CTTAAG-5 3-C

6、TTAA G-5,C. 3端突出的粘性末端：從3端切割 如：5-CTGCAG-3 Pst 5-CTGCA + G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5 5、 同功異源酶：來源不同，但識別和切割位點相同的酶 如：BamHI 和 Bst（GGATCC） 6、同尾酶：識別序列不同、但可產(chǎn)生相同的粘性末端 如： BamHI（GGATCC）和San3AI(NGATCC) 7、不同限制酶作用時所需要的鹽濃度不同，應(yīng)使用相應(yīng)的緩沖液,二、 修飾酶 （一）DNA 聚合酶（DNA polymerase ) 來源于E.coli, Mr 109KD,有三種酶活性（多功能酶）： 1、 5 3聚合酶活性：以

7、DNA為模板，dNTP為原料，使 DNA鏈從5-3 延伸 2、5 3外切酶活性，5 3 3、3 5外切酶活性： 5 3 應(yīng)用： 缺口平移法（nick translation）標(biāo)記DNA探針,Klenow 片斷：是DNA pol的一個大片斷，Mr 76KD，去掉 5 3 外切酶活性，保留5 3聚合酶活性， 3 5外切酶活性 應(yīng)用： A、補齊雙鏈DNA的3 端 B、通過補齊3-端使3 端標(biāo)記 C、在cDNA克隆中，用于cDNA第二鏈的合成 D、DNA序列分析,通過mRNA合成cDNA,RNase H klenow 大片段合成第二鏈,cDNA,（二）逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptas

8、e) 是依賴于RNA的DNA聚合酶，用于將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 構(gòu)建cDNA文庫。常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種： AMV：來源于禽成骨細(xì)胞性白血病病毒 從病毒顆粒 MMLV：來源于小鼠白血病病毒 中得到。,（三）T4 DNA ligase 將兩段DNA分子拼接起來的酶，叫DNA連接酶， 催化5-P和3-OH 形成磷酸二酯鍵。 T4 DNA連接酶要求底物必須是雙鏈核酸。在斷點的 3端帶有羥基，斷點的5 端帶有磷酸基。,（四）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase) 催化核酸的5 端脫去磷酸基團(tuán)的反應(yīng)。其底物可以 是單鏈或雙鏈的DNA和RNA。有細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP) 和牛小腸堿性磷酸

9、酶(CIP)兩種。 作用：能去除DNA或RNA 5-端的磷酸根 用途：防止載體自身成環(huán)，提高重組效率,（五）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 (terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT) 作用：催化dNTP加到DNA的3-OH 端 用途：A、3- 端標(biāo)記，制備探針 B、給載體和待克隆的片段接上互補的同聚 物尾，造成便于重組的人工粘性末端,第二節(jié) 載 體 （vector） 一、定義：用來攜帶目的基因片段進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA 克隆載體：用來克隆和擴增DNA片段的載體 按功能分 表達(dá)載體：用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體 （表達(dá)載體比克隆載體復(fù)雜，多一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)

10、的元件） 二、克隆載體應(yīng)具備的條件： （一）能夠在受體細(xì)胞中復(fù)制，并能攜帶重組DNA片段一同擴增 （二）帶有遺傳標(biāo)志，便于篩選，如 Amp r 編碼一個酶，可將氨,芐青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)水解，解除其毒性。Tet r 編碼一種膜 結(jié)合蛋白，阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞 （三）帶有多克隆位點（multiple cloning site, MCS )，即限制性 內(nèi)切酶的識別、切割、位點。MCS是外源DNA插入的部位。 （四）分子量相對較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在 表達(dá)載體除了有克隆載體的特點外，尚有啟動子（在插入 DNA片段的上游）、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始信號和起始 密碼、插入DNA片段的下游有轉(zhuǎn)錄終止信號和終止

11、密碼。,三、 常用的克隆載體： （一） 質(zhì)粒（plasmid): 是細(xì)菌染色體以外的能自主復(fù) 制的環(huán)狀閉合雙鏈DNA分子。 如：PBR322質(zhì)粒，PUC系列 包裝容量（允許插入外源DNA的長度，size)： 10kb,(二）噬菌體（bacteriaphages，phages)： 是感染細(xì)菌的病毒 溶源性（ lytic) 按其生活周期分為 溶菌性(lysogenic) 噬菌體是48.5kb的雙鏈線形DNA分子 COS位點：分子兩端各有12個堿基的互補單鏈 是天然的粘性末端，稱COS位點，可成環(huán)狀 包裝容量：20kb+,2 噬菌體 (bacteriophage，phage) 感染細(xì)菌的病毒，按其生

12、活周期分為兩種類型，一類為溶菌性(lytic)，另一類稱為溶原性(lysogenic)。溶菌性噬菌體感染細(xì)菌后連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放出的噬菌體又可感染其它細(xì)菌。溶原性噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，和細(xì)菌的染色體一起復(fù)制。用作克隆載體的噬菌體有兩種：一種是噬菌體.namda vector.doc，另一種是M13噬菌體。 野生型噬菌體全長48.5kb，在病毒顆粒中為雙鏈線性分子，兩端帶有12 個堿基的單鏈粘性末端。噬菌體進(jìn)入大腸桿菌后即通過粘性末端的堿基配對形成環(huán)狀分子，它既可溶菌生長，又可溶原生長。 目前常用的噬菌體 EMBL系列、gt系列、Charon系列的結(jié)

13、構(gòu)簡圖Fig8-3,BamH I,EcoR I,Sal I,BamH I,EcoR I,Sal I,BamH I,EcoR I,Sal I,BamH I,EcoR I,Sal I,44 kb,44 kb,EMBL3,EMBL4,21 kb,13 kb,10 kb,圖8-2 EMBL 3和 EMBL 4 結(jié)構(gòu)簡圖,( 三）粘性質(zhì)粒( 柯斯質(zhì)粒、cosmid vector ) 質(zhì)粒DNA：有抗藥基因，MCS，自我復(fù)制 組成 噬菌體 ：COS位點 包裝容量：40Kb+,（四）M13 噬菌體： 單鏈閉合環(huán)狀DNA分子，感染細(xì)菌后可轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈的 復(fù)制型DNA（replicational form DNA

14、, RF DNA) 包裝容量： 1kb,M13噬菌體的最大優(yōu)點是噬菌體顆粒中所含的是 單鏈DNA，該單鏈DNA可作為模板用于DNA序列 分析，利用單鏈M13克隆可制備成單鏈DNA探針 用于雜交分析，檢測DNA或RNA，或者作為基因 定點誘變的載體。噬菌體成熟后鉆出宿主細(xì)胞而 不破碎細(xì)胞，可以從細(xì)菌培養(yǎng)液的上清液中獲得 噬菌體，制備單鏈DNA，而雙鏈?zhǔn)删wDNA可通 過裂解細(xì)菌進(jìn)行制備。,( 五）酵母人工染色體載體（yeast artificial chromosome vector,YAC) 酵母基因：著絲粒、端粒 YAC組成 質(zhì)粒DNA：ori、Ampr 包裝容量：0.5-2Mb 細(xì)菌人工染

15、色體（bacterial artificial chromosome,BAC) 包裝容量： 0.1- 0.4Mb 哺乳動物人工染色體（mammalian artificial chromosome, MAC) 目前也在發(fā)展中。,二 、表達(dá)載體（expressing vector) 用來在受體細(xì)胞中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體 克隆載體所具備的條件 具備條件 轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列 （一）大腸桿菌表達(dá)載體 表達(dá)元件：啟動子RBS克隆位點（外源DNA的插入 位點） 轉(zhuǎn)錄終止信號,1、 promoter: 常用tac、噬菌體 PL、 T 7 噬菌體啟動子 1） tac啟動子：全稱 trp-

16、lac啟動子，是一個雙啟動子、雜合啟 動子，組成：trp P + lac O + SD lac阻抑物可抑制其表達(dá) IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）可誘導(dǎo)其表達(dá) 2） 噬菌體PL啟動子：受控于溫度敏感的阻抑制（cIts857) 是一個溫度誘導(dǎo)的啟動子 37度時，cIts857可以阻抑PL啟動子的轉(zhuǎn)錄 42度時，失去阻抑作用,3）T 7 噬菌體啟動子：表達(dá)效率高，需特殊的受體菌。 2、核糖體結(jié)合位點（ribosome-binding site, RBS) RBS是大腸桿菌表達(dá)載體中必不可少的元件 3、轉(zhuǎn)錄終止序列：多數(shù)外源基因的表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄終止序列 （二）哺乳動物表達(dá)載體 真核表達(dá)載體含有一套真核表

17、達(dá)元件：啟動子/ 增強子克隆 位點終止信號和加poly(A)信號 1、啟動子/ 增強子必須是真核細(xì)胞的，有些來源于病毒的啟動子/ 增強子常用，如：SV40病毒，人類巨細(xì)胞病毒（CMV）,2、真核載體必須帶有poly(A)位點下游序列，以保證 新轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠加上 poly(A)，即GU富含區(qū)或加尾 信號AAUAAA,轉(zhuǎn)錄終止和加poly(A)：真核基因表達(dá)的過程中，RNA 聚合酶通?？邕^poly(A)位點繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因此，成 熟的mRNA3 端是經(jīng)過位點特異性的轉(zhuǎn)錄后切割并加上 poly(A)而形成的。 準(zhǔn)確而有效地加上poly(A)，有賴于mRNA中不同的序 列，一是位于poly(A)

18、位點下游的GU富集區(qū)或U富集區(qū)， 二是poly(A)加尾信號：AAUAAA。真核表達(dá)載體必須帶 有poly(A)位點下游序列，以保證新轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠有 效地加上poly(A)。,第三節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本過程 克隆某個特定基因 重組DNA技術(shù)的目的 表達(dá)某個特定基因,基本過程包括： 1 目的基因的獲取和載體的選擇構(gòu)建 2 目的基因與載體的拼接 3 重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 4 DNA重組體的篩選和鑒定 5 DNA重組體擴增、表達(dá)及其他研究,第三節(jié)、重組DNA的基本過程,一 、 目的基因的獲取 （一）目的基因的定義 指所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因 （二）常用的制備方法

19、 1 從genomic DNA library (也叫G-文庫) 中篩取 genomic DNA library:提取生物體全部DNA,酶切后與同一 載體連接,轉(zhuǎn)化后全部保存在宿主菌中,這些轉(zhuǎn)化菌的總和即 genomic DNA library .即用總DNA建造的文庫,也叫G-文庫. 2 從cDNA文庫(也叫C-文庫)中篩取,2 從cDNA文庫(也叫C-文庫)中篩取 cDNA library:用細(xì)胞全部的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄制備全套cDNA,使每 一個cDNA分子都與一個載體分子拼接成重組DNA。將所有的重 組DNA分子都引入宿主細(xì)胞，這些轉(zhuǎn)化菌的總和即cDNA文庫 (C-文庫只包含exon ,

20、不包含intron及不表達(dá)的DNA序列),雖然一個個體的所有細(xì)胞均具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，但在同一機體 不同類型的細(xì)胞或同一細(xì)胞在生長發(fā)育的不同階段，以及受到不同 因素(物理、化學(xué)或生物因素)的刺激，基因表達(dá)的種類與數(shù)量是不 同的。cDNA文庫是指某種特定細(xì)胞及特定狀態(tài)下的全部cDNA克 隆，只有在細(xì)胞內(nèi)存在mRNA，才能建成相應(yīng)的cDNA文庫，所以 不同種類及不同狀態(tài)的細(xì)胞有不同的cDNA文庫。,3 直接用限制酶切取：適用于背景資料清楚的原核生 物 4 PCR擴增目的基因 以mRNA為模板，常用RT-PCR可得到所需目的基因 5 化學(xué)合成法：利用DNA合成儀 對目的基因分別合成，再進(jìn)行連接 缺

21、點：價格昂貴,通過mRNA合成cDNA,RNase H klenow 大片段合成第二鏈,cDNA,二 載體的選擇和制備 噬菌體、粘性質(zhì)粒：適用于構(gòu)建基因組文庫 pUC系列質(zhì)粒：適用于構(gòu)建cDNA文庫，克隆較小 的DNA片段 M13噬菌體：適用于DNA測序 表達(dá)載體：適用于表達(dá)某個特定的基因,三 DNA分子的體外連接 重組DNA分子指目的DNA與載體DNA組成的雜種DNA分 子, 又稱嵌合DNA (chimera) (1)同一限制酶切割位點的連接: 同一限制酶切割供體和載體DNA 產(chǎn)生相同的粘 性末端 DNA連接酶連接成新的DNA分子。,優(yōu)點：簡單、高效?？寺》敝澈笥猛幌拗泼赶?，可 回收目的

22、基因 缺點：高背景（載體DNA兩端也具有粘性末端，可自身環(huán) 化成空白載體） 防止辦法：1、用高濃度的外源DNA（插入片段與載體比 例 5- 10：1） 2、用堿性磷酸酶將載體的5-P切去，不能自 身成環(huán)。,(二） 人工接頭連接 人工接頭：人工合成含多種常用限制酶識別序列的雙鏈DNA 短片段（8-12bp)，此即接頭（linker) 作用：平端添加新的酶切位點，產(chǎn)生粘性末端，便于連接。 （三）同聚體尾連接 方法：利用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT），催化dNTP加到DNA3末端 構(gòu)成脫氧核苷酸的同聚體尾 如：載體DNA-3-OH加polyG, + 目的基因3-OH加polyC DNA連接酶 重組體,（四）

23、平端連接 方法： 可在DNA連接酶作用下直接連接平端的 DNA片段與載體。 缺點：效率低，需更多的 ATP及DNA連接酶,四 將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞 （一）轉(zhuǎn)化：指將質(zhì)粒或其他外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的過 程。轉(zhuǎn)化常用的宿主菌是：大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞（competent cell):用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞， 使細(xì)胞處于最適合攝取和容忍外源DNA的生理狀態(tài) 感受態(tài)后才有較高的轉(zhuǎn)化效率，這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì) 胞 感受態(tài)細(xì)胞可以懸浮于50甘油中，-80保存6個月而不喪失活性。,制備感受態(tài)細(xì)胞常用的方法： 1、化學(xué)法：用冰冷、低滲的氯化鈣溶液，細(xì)菌處于氯化鈣低滲溶 液中 細(xì)胞膨脹成球形 通透性增加，DNA

24、黏附于細(xì) 胞表面 經(jīng)42短暫熱休克處理 促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA 高頻電流 2、電穿孔法：外源DNA和大腸桿菌混合于電穿孔杯 細(xì)胞出現(xiàn)許多小孔 DNA進(jìn)入細(xì)胞,（二）感染 (infection)：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為 載體的重組DNA分子，在體外包裝成具有感染能力的病毒 或噬菌體顆粒，感染宿主細(xì)胞的過程。 感染效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)化效率 粘粒也可經(jīng)轉(zhuǎn)化程序，將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，但轉(zhuǎn)化效率非 常低。,（三）轉(zhuǎn)染(transfection)：是由轉(zhuǎn)化和感染兩個詞構(gòu)成 的新詞，指真核細(xì)胞主動攝取或被動導(dǎo)入DNA而獲 得新的表型的過程。,五 目的基因的篩選和鑒定 篩選在不同的水平上進(jìn)行，以區(qū)別 1

25、 轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子：并非每個細(xì)胞都能被轉(zhuǎn)化 2 重組子與非重組子：轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并非都含有目的基 因，可能有的是含有自身成環(huán) 的載體 3 鑒定特異性重組子：一個載體可能與兩個外源DNA 連接，或非目的基因插入載體,（一）遺傳學(xué)方法 1、轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子的篩選抗菌素平板篩選 質(zhì)粒、粘粒：有抗藥標(biāo)記，在含Amp或Tet平板上能生長的 - 轉(zhuǎn)化子，未被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌就被殺死 2、重組子與非重組子的篩選插入失活篩選,（1）插入失活（ insertion inactivation): 許多載體帶有兩個或 兩個以上抗藥基因，外源DNA插入某一抗藥基因內(nèi)該基因就 會失活,如PBR322質(zhì)粒含Ampr,Tetr ,

26、Tetr上有一個BamH 位點，如 將外源DNA通過BamH 位點插入到Tet r基因內(nèi)， Tet r 基因 失活 轉(zhuǎn)化細(xì)胞只能在Amp平板上生長，不能在Tet平板上 生長 若在Amp和Tet平板上都能生長，則可能是PBR322自身成環(huán) 后的轉(zhuǎn)化子,插入滅活法篩選重組體,（2） -互補（-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)，蘭白斑選擇） 某些載體中插入了編碼-半乳糖苷酶N-端145個氨基酸的核 苷酸序列 ， 即lacZ gene，其中含多克隆酶切位點 無外源DNA插入時 載體表達(dá)-肽（在IPTG活化下） 宿主編碼-肽缺陷的-半乳糖苷酶（肽） 互補 有活性的 -半乳糖苷酶 X-gal（酶的底物） 蘭色菌斑 有外

27、源DNA插入lacZ時 插入失活 載體不表達(dá)-肽 無有 活性的 -半乳糖苷酶 白色菌斑 （陽性重組子為白色菌斑）,（二）免疫學(xué)方法： 當(dāng)外源基因在宿主細(xì)胞實現(xiàn)表達(dá) 外源蛋白 抗該外源蛋白抗體 目的基因編碼的蛋白做抗原 （三）核酸雜交法： 菌落原位雜交 分子雜交 斑點雜交 Southern blotting 探針：與目的基因互補的DNA序列,（四）用核酸雜交法進(jìn)行分析鑒定： 為了進(jìn)一步鑒定重組基因體中的目的基因，可采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結(jié)果為陽性，即可確定重組體中帶目的基因。,（四）PCR技術(shù) 根據(jù)目的基因序列設(shè)計引物，具有高

28、度的靈敏度和特異性 （五）電泳篩選 從含有質(zhì)粒的菌落中抽提DNA 瓊脂糖電泳 跑的慢的 外源DNA插入,第四節(jié) 真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染,一、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法和原理 （一）磷酸鈣共沉淀法 （calcium phosphate co-precipitation） 外源DNA或重組DNA 磷酸鈣 微小顆粒 + 宿主細(xì)胞 顆粒沉積在細(xì)胞表面 利于宿主細(xì)胞攝取 （二）電穿孔法：同原核細(xì)胞,（三）DEAE葡聚糖（DEAE-Dextran）法 DNA 黏附于細(xì)胞表面 + 借助細(xì)胞內(nèi)吞促進(jìn) DEAE-Dextran 外源DNA進(jìn)入 （四）脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)基因?qū)?陽離子脂質(zhì)體 黏附于細(xì)胞表面 混合物

29、 DNA被釋放到胞漿 DNA （五）顯微注射法 將外源基因通過毛細(xì)玻璃管在顯微鏡下直接注射到細(xì)胞核內(nèi),第五節(jié) 克隆基因的表達(dá),原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá) 真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)：E.coli是最成功 的原核表達(dá)體系 克隆基因的 表達(dá)分為四 原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 種 真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá),一 原核與真核基因在結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控上的差異 （一）真核基因的啟動子不能被E.coli RNA聚合酶所識別，所以 不能有效轉(zhuǎn)錄 （二）真核基因內(nèi)含內(nèi)含子，而原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加 工，即轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA不能加工成mRNA，所以要表達(dá)的 真核基因必須是mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-cDNA（不含內(nèi)含子）

30、（三）真核基因轉(zhuǎn)錄的mRNA缺乏S-D序列，所以不能被翻譯 （四）原核細(xì)胞內(nèi)缺乏真核細(xì)胞特有的翻譯后加工體系，所以原核 表達(dá)體系僅適用于表達(dá)那些翻譯后修飾對其生物學(xué)功能并非 必需的真核蛋白,（五）某些真核蛋白具有信號肽序列（signal sequence） 信號肽 被真核細(xì)胞的 蛋白前體 信號肽酶識別 + 加工成成熟的蛋白 原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)此蛋白前體后 信號肽不能被切除 蛋 白前體無活性，所以表達(dá)的真核基因需要刪除信號肽序列， 才能使表達(dá)的蛋白有活性 （六）表達(dá)的真核蛋白在原核中不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解,二、真核克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá) （一）目的基因 1、必須是cDNA 2、目的基因的上游

31、是原核的S-D序列 3、去除cDNA的啟動子 4、對于分泌性蛋白，還應(yīng)去除編碼信號肽的序列 （二）載體 所用載體必須是大腸桿菌表達(dá)載體，含有大腸桿菌RNA聚合 酶所能識別的啟動子和S-D序列,（三）真核基因在 E.coli中表達(dá)方式 1、融合蛋白(fusion protein)：是指表達(dá)的蛋白N端是原核基因 編碼，C端是克隆的真核DNA編碼 其轉(zhuǎn)錄單位： 原核P S-D 原核結(jié)構(gòu)基因 真核結(jié)構(gòu)基因 轉(zhuǎn)錄 S-D mRNA 翻譯 N C 原核 真核,在表達(dá)融合蛋白時，為得到正確編碼的表達(dá)蛋白，在插入外源基 因時，其閱讀框架應(yīng)與原核DNA片段的閱讀框架一致，這樣，插入 的外源基因在翻譯時才不致產(chǎn)生

32、移碼突變 融合蛋白的優(yōu)點： 1、穩(wěn)定，不易被細(xì)菌蛋白酶降解 2、可利用針對原核部分的單抗進(jìn)行親和層析，便于純化 3、原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，釋放出天然的真核蛋白,二、真核基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá) 該真核基因可以是基因組DNA，也可以是cDNA 轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞可用磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)等,真核基因在其他表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá) （一）昆蟲表達(dá)體系 （二）酵母表達(dá)體系,第六節(jié) 目的基因的定點誘變及其應(yīng)用,基因定點誘變(site-directed mutagenesis)是指將基因 的某一個或某些位點進(jìn)行人工替換或刪除的過程。這 些方法已成為蛋白質(zhì)工程中定向改變基因結(jié)構(gòu)的主要 方法。,一、基

33、因定點誘變技術(shù) (一)寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變法 用于刪除或置換DNA 片段中的核苷酸。例如，可以用來改變蛋白質(zhì)編碼序 列的個別密碼子，從而改造蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；或使具有 調(diào)控功能的序列發(fā)生變化，以確定DNA特定的功能區(qū) 域。而且還可以利用寡核苷酸介導(dǎo)的誘變構(gòu)建新的載 體或嵌合基因。例如可在表達(dá)載體中預(yù)先選定的位置 上，插入諸如核糖體結(jié)合位點或聚腺苷酸化(加polyA 尾)信號等序列；又如在指定位置上除去某種限制性酶 切位點并加入便于使用的限制酶切位點；,原理：利用Klenow片段延伸與單鏈環(huán)狀DNA模板相 配對的寡核苷酸引物，這個寡核苷酸引物除了有一 處與模板的堿基錯配外，其余部分全部與模板互補

34、，由此寡核苷酸的錯配處誘發(fā)突變，并在體外新合 成一個雜合雙鏈DNA，最后用T4DNA連接酶將新合 成的雜合雙鏈DNA連接成雙鏈閉環(huán)DNA分子。將體 外合成的雜合閉環(huán)DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞，由于 單鏈環(huán)狀DNA復(fù)制的特點，就會同時產(chǎn)生野生型與 誘變型兩種DNA分子。最后通過篩選，將誘變型 DNA分子篩選出來。,圖8-7 寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變基本步驟,含有誘變位點的寡核苷酸引物的長度一般為2030 個堿基。在設(shè)計寡核苷酸引物時，誘變堿基的位置應(yīng) 放在引物的中間，以免受到外切核酸酶的破壞。如錯 配部位靠近3 端，則易為DNA聚合酶從3 端進(jìn)行修 復(fù)。可事先利用計算機尋找誘變引物與重組載體間的 同源部位，同源部位出現(xiàn)越少越好，以防止產(chǎn)生非預(yù) 期的配對。如果發(fā)現(xiàn)有多個部位相互競爭的話，可將 合成的誘變寡核苷酸引物適當(dāng)加長。,（二）、PCR定點誘變法,PCR定點誘變法是一種高效定點誘變方法。PCR定點誘變法的基本原理是：除了合成所需的5 端及3 端常規(guī)引物(a，d)之外，再合成一對帶有誘變位點的互補寡核苷酸引物(b，c)，具體步驟如圖8-8所示。分別利用誘變引物b和5 端引物a，以及誘變引物c和3 端引