擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB73抗核盤(pán)菌的分子機(jī)制研究

1、擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB73抗核盤(pán)菌的分子機(jī)制研究由核盤(pán)菌 (Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病常在世界范圍內(nèi)的糧油、蔬菜等作物生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究植物抗核盤(pán)菌的分子機(jī)制, 對(duì)于培育作物抗核盤(pán)菌的新品種具有重要意義。本研究中 , 我們分離鑒定了 1 個(gè)擬南芥抗核盤(pán)菌相關(guān)基因MYB73,并研究了MYB73在植物抗病反應(yīng)中的功能, 進(jìn)一步利用酵母雙雜交技術(shù), 獲得 MYB73互作蛋白 , 為完善植物的抗病信號(hào)網(wǎng)絡(luò)和指導(dǎo)病害防治提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下 :1. 通過(guò)對(duì) myb73進(jìn)行抗病性測(cè)定 , 發(fā)現(xiàn) myb73接種核盤(pán)菌后其病斑面積明顯大于野生型 (WT)

2、, 且 myb73中核盤(pán)菌 SsTUBULIN的表達(dá)水平也明顯高于 WT,明確了myb73為核盤(pán)菌敏感突變體。進(jìn)而獲得 MYB73超表達(dá)植株 (OE), 經(jīng)抗病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)MYB73超表達(dá)植株對(duì)核盤(pán)菌的抗性明顯高于野生型, 分析了接種核盤(pán)菌后WT,myb73和 OE植株中 POD活性和 MDA含量 , 確定 MYB73為擬南芥抗核盤(pán)菌相關(guān)基因。2. 對(duì) WT、myb73和 OE植株接種致病細(xì)菌丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pvtomato DC3000,Pst DC3000), 結(jié)果發(fā)現(xiàn) myb73對(duì) Pst DC3000 抗性增強(qiáng) , 且 OE對(duì)Pst

3、DC3000的感病程度與 WT相似 ,Real time-PCR 分析發(fā)現(xiàn) ,PstDC3000侵染 WT后 ,MYB73表達(dá)明顯下調(diào) , 抗病相關(guān)基因 PR1,PR3,PR5和 PDF1.2的表達(dá)在接種不同時(shí)間均出現(xiàn)上調(diào) , 表明 MYB73為擬南芥抗 Pst DC3000 的負(fù)調(diào)控因子。3.RT-PCR分析發(fā)現(xiàn) ,myb73 中 PR1和 PDF1.2表達(dá)與 WT中沒(méi)有明顯差別 , 表明MYB73基因功能缺失不直接影響PR1和 PDF1.2的表達(dá) ;myb73 中 SOD,POD和 CAT的表達(dá)低于 WT,但 PAL和 PPO的表達(dá)高于 WT,表明 MYB73與抗氧化基因表達(dá)相關(guān) ;myb

4、73中 NPR1表達(dá)被抑制 , 同時(shí) npr1 中 MYB73表達(dá)被抑制 , 表明 MYB73與 NPR1的表達(dá)具有相互協(xié)同作用;eds5,sid2,npr1和 jar1 突變體中 ,MYB73表達(dá)低于 WT,同時(shí)水楊酸 (salicylic acid,SA)處理 eds5,sid2和 nahG及茉莉酸 (jasmonicacid,JA) 處理 jar1突變體后 ,MYB73表達(dá)被誘導(dǎo) , 表明 MYB73的表達(dá)依賴(lài)于EDS5,SID2,NahG和 JAR1,且受 SA和 JA 信號(hào)途徑調(diào)控。 4.SA、 JA 和 ACC處理 WT和 myb73不同時(shí)間 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) WT和 myb73中 P

5、R1和 PDF1.2 的表達(dá)沒(méi)有明顯變化 ,ACC處理 WT 12 h 后 ICS1 表達(dá)上調(diào) , 但 ACC處理 myb73 12 h 后 ICS1 表達(dá)沒(méi)有增加 , 表明 MYB73功能缺失抑制了 ACC對(duì) ICS1 的誘導(dǎo)表達(dá)。核盤(pán)菌接種 WT和 myb73后, 結(jié)果發(fā)現(xiàn) WT和 myb73突變體中 PR1和 PDF1.2的表達(dá)沒(méi)有明顯變化 , 但接種核盤(pán)菌 1 h 后,myb73 中 ICS1 的表達(dá)顯著下降 , 表明核盤(pán)菌侵染過(guò)程中 ,MYB73功能缺失抑制了ICS1 的表達(dá)。 5. 不同濃度的 SA、 JA和 ACC處理 WT和 myb73,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 100M的 JA 處理后 ,m

6、yb73 根的抑制程度明顯小于 WT,而 SA和 ACC處理后 ,myb73 根的生長(zhǎng)和下胚軸的生長(zhǎng)與WT相似 , 表明MYB73功能缺失減弱了JA 對(duì)擬南芥根的抑制作用。6.HPLC分析發(fā)現(xiàn) ,myb73 中的 SA含量與 WT沒(méi)有明顯差別 , 但核盤(pán)菌侵染 24 h后 myb73中的 SA含量明顯低于 WT;ELISA分析發(fā)現(xiàn) ,myb73 中的 ABA含量明顯低于 WT,而核盤(pán)菌侵染 24 h 后 myb73和 WT中的 ABA含量均出現(xiàn)上調(diào) , 但 myb73中ABA的含量依然低于 WT,說(shuō)明 MYB73功能缺失抑制了 SA的誘導(dǎo)合成和 ABA的積累。7. 本研究構(gòu)建了 MYB73的誘餌表達(dá)載體 , 轉(zhuǎn)錄活性分析確定 MYB73具有很高的轉(zhuǎn)錄激活活性 , 其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于 C 端。以 MYB73為誘餌 , 利用酵母雙雜交體系篩選擬南芥 cDNA文庫(kù) , 獲得了 15 個(gè)陽(yáng)性克隆。 RT-PCR分析發(fā)現(xiàn) , 核盤(pán)菌侵染 24 h 后 AT1G12080編碼基因 F12F1.4 在WT中表達(dá)明顯下調(diào) , 在 myb73中表達(dá)明顯上