第十五章基因重組與基因工程

1、第十五章 基因重組與基因工程,思路： 定義 基因重組 意義 （自然） 方式：接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)座 基因重組 類型 定義 基因工程 意義 （人工） 基本要素 原理 臨床,第一節(jié) 自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組,一、定義： 基因重組：指細(xì)胞基因組中DNA順序重新 排列組合的現(xiàn)象。 二、意義：基因變種、物種演變、進(jìn)化的基礎(chǔ) 三、方式： 接合 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)座,1接合:指供體細(xì)胞（細(xì)菌）和受體細(xì)胞（細(xì)菌） 接觸，使DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞 的過(guò)程。 . 例:較大質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移 2轉(zhuǎn)化：指外源DNA被引入細(xì)胞，導(dǎo)致其遺傳和生 物性狀改變的過(guò)程。 方式：自動(dòng)獲取外源DNA 基因重組（自然） 人為供給

2、外源DNA 基因工程 例：細(xì)菌抗藥性 3轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為媒介、將供體菌的DNA片段轉(zhuǎn)移到 受體菌基因組的過(guò)程。 例：噬菌體感染宿主菌,4轉(zhuǎn)座：指可移動(dòng)的DNA序列（游動(dòng)基因） 從基因組的 一處移動(dòng)到另一處 的過(guò)程。 游動(dòng)基因 介導(dǎo)形式 保守性轉(zhuǎn)座 復(fù)制性轉(zhuǎn)座 種類 插入序列 轉(zhuǎn)座子 a.插入序列：轉(zhuǎn)座酶基因反向重復(fù)序列 b. 轉(zhuǎn)座子 定義：可從染色體一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到 另一位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列。 結(jié)構(gòu)：插入序列特殊序列（e.g:抗性基因,四、類型,位點(diǎn)特異重組:由整合酶催化，在兩個(gè)DNA 序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。 2.同源重組(基本重組) 定義：發(fā)生在同源序列間的重組。 (依賴DNA間同源性，不

3、是特異性) 機(jī)制： a.產(chǎn)生中間體 b.分解中間體,第二節(jié) 基因工程（重組DNA技術(shù),一、定義：指在體外用人工（酶學(xué)）的方法， 將目的基因與載體DNA重組， 并把重組體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞， 使目的基因擴(kuò)增和表達(dá)的技術(shù)。 也稱：重組DNA、重組DNA工藝學(xué)、 DNA克隆、基因克隆、重組DNA技術(shù)。 克?。╟lone）：指由同一個(gè)始祖經(jīng)過(guò)無(wú)性繁 殖所形成的副本或拷貝集合。 克隆化 ：獲得同一拷貝的過(guò)程,二、意義 擴(kuò)增基因、生產(chǎn)蛋白、創(chuàng)造新種,三、基本要素 酶 目的基因 載體基因 宿主,一）、工具酶 限制性核酸內(nèi)切酶 定義：識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別 位點(diǎn)或其周圍切割DNA雙鏈的 一類內(nèi)切酶.

4、分類：I、II（常用）、III類 命名 II類酶 特點(diǎn) 識(shí)別點(diǎn)是DNA回文結(jié)構(gòu) 切割方式 粘性末端 5粘端 3粘端 平頭末端 配伍末端 識(shí)別點(diǎn)不同， 末端相同,二）、目的基因 定義：是指所要研究或應(yīng)用的基因。 類型：cDNA（互補(bǔ)DNA） 基因組DNA 來(lái)源: 化學(xué)合成 （人工合成） 基因組DNA文庫(kù) (全部基因組DNA的集合) cDNA文庫(kù) (含全部mRNA信息) PCR （聚合酶鏈反應(yīng),PCR:指在反應(yīng)體系中加入模板、dNTP、 引物、DDRP和緩沖液；經(jīng)多次（25-30） 變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)；使目基因擴(kuò)增（指數(shù)增長(zhǎng)）的過(guò)程,三)基因載體 定義：為攜帶目的基因、實(shí)現(xiàn)無(wú)性繁殖或表達(dá) 成

5、有意義的蛋白質(zhì)而采用的DNA分子。 作 用：攜帶目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞。 特征： 常用： 質(zhì)粒DNA :pBR323 噬菌體DNA:pUC19 粘粒 病毒DNA YAC( 酵母人工染色體載體,四、基本原理,過(guò)程: 分、選（切）、接、轉(zhuǎn)、篩、表。 1分離目的基因。（目的基因的獲?。?2選擇與構(gòu)建基因載體。 (切割目的基因和載體基因，便于連接。） 3連接目的基因與載體。 4重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌（細(xì)胞）。 5篩選重組體。（含目的基因的受體菌或細(xì)胞）。 6目的基因的表達(dá)。 e.g: 質(zhì)粒為載體進(jìn)行DNA克隆,一）、目的基因的獲取 途經(jīng) 1.化學(xué)合成法。 DNA合成儀 2.基因組DNA文庫(kù)中篩選。 限制性

6、內(nèi)切酶 3.cDNA文庫(kù)中篩選。 用于分離編碼蛋白的基因 4.PCR dNTP 目的基因 酶、引物、模板,二）、克隆載體的選擇和構(gòu)建 a. 常用載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA。 b. 目的基因離開(kāi)染色體不能復(fù)制， 需在載體 (染色體）才能復(fù)制。 c. 根據(jù)操作基因的性質(zhì)、目的 對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切割,三）、外源基因與載體的連接 原理： 目的基因+載體 重組DNA分子 DNA連接酶 方式： 粘性末端 自然 同一酶切點(diǎn)的連接 （主） 不同酶切點(diǎn)的連接 人工 同聚物加尾連接 人工接頭連接 平頭連接 相同或不同酶切后連接,四）、重組體DNA導(dǎo)入受體菌 方式： 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 感染 受體菌條件：安全宿主菌

7、 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) 過(guò)程：無(wú)性繁殖。 重組DNA導(dǎo)入受體菌，隨受體菌生長(zhǎng)、 繁殖，重組DNA分子得以復(fù)制、 擴(kuò)增的 過(guò)程,五）、重組體的篩選 篩選（選擇）：將培養(yǎng)基中眾多的轉(zhuǎn)化 菌落（菌斑）分開(kāi)，并鑒定 出帶有目的基因的菌落的過(guò)程。 方法： 直接法 抗藥性標(biāo)志選擇 標(biāo)志補(bǔ)救 分子雜交法 非直接法 免疫化學(xué)法 酶聯(lián)免疫檢測(cè)法,六）、克隆基因的表達(dá) 重組DNA技術(shù)目的 ： 獲得大量目的基因 基本目的 目的基因表達(dá)（蛋白質(zhì)表達(dá)） 醫(yī)藥應(yīng)用 蛋白表達(dá)體系 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化 意義：合成有藥用價(jià)值的蛋白或多肽 方式：原核表達(dá)體系 真核表達(dá)體系,五、臨床,1

8、.診斷 a. DNA診斷 b. DNA診斷的應(yīng)用 產(chǎn)前診斷 攜帶者診斷 癥狀前診斷 預(yù)防 易感性診斷 器官移植組織配型 法醫(yī) 2.治療 a. DNA治療（基因治療） e.g:間接體內(nèi)體細(xì)胞基因治療（ex vivo） b. 生物制藥,基本程序,1.選擇治療性基因（目的基因） 2.選擇基因載體 3.選擇靶細(xì)胞（受體細(xì)胞） 4.基因轉(zhuǎn)移（外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞）。 間接方式 病毒載體 5.篩選外源基因（利用標(biāo)記物） 6.回輸體內(nèi)（以不同方式回輸獲得 治療性基因修飾后的細(xì)胞,一、接合作用（conjugation) 當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過(guò)菌毛相互接 觸時(shí)，質(zhì)粒DNA從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至 另一細(xì)胞（細(xì)

9、菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用,二、轉(zhuǎn)化作用（transformation) 通過(guò)自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA， 使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型,三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction) 當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體） 釋放出來(lái)，再次感染另一細(xì)胞（受體）時(shí)，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間 的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組,圖 15-3 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過(guò)病毒介導(dǎo)發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞 之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組,插入序列轉(zhuǎn)座 插入序列（insertion sequences，IS）： 長(zhǎng)750 1500bp 組成： 反向重復(fù)序列：941bp，位于兩側(cè) 轉(zhuǎn)座酶編碼基因：產(chǎn)物引起轉(zhuǎn)座，位于中間 正向

10、重復(fù)序列：412bp，位于反向重復(fù)序列外側(cè)，為插入序列所特有,轉(zhuǎn)座： 1. 保守性轉(zhuǎn)座 從原位遷至新位 2. 復(fù)制性轉(zhuǎn)座 插入序列復(fù)制后，一個(gè)復(fù)制本遷到 新位，另一個(gè)保留在原位,保守性復(fù)制,插入序列,反向重復(fù)序列,靶位點(diǎn),內(nèi)切酶裂解,轉(zhuǎn)座酶,切端形成新的磷酸,二酯鍵 (轉(zhuǎn)座酶,新 DNA (poly I) 合成,與連接 (轉(zhuǎn)座酶,位點(diǎn)特異的,重組 (轉(zhuǎn)座酶,老定位,新定位,圖 15-4 插入序列的復(fù)制性轉(zhuǎn)座,3,3,5,5,3,5,3,5,轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座 轉(zhuǎn)座子（transposons）：可從一個(gè)染色體 位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一位點(diǎn)的分散重復(fù)序列。 反向重復(fù)序列 組成 轉(zhuǎn)座酶基因 特殊基因：如抗生素抗性基因

11、等,3,5,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,內(nèi)切酶,recBCD,DNA侵?jǐn)_ recA,分支遷移,recA,內(nèi)切酶 recBCD,DNA 連接酶,Holliday中間體,機(jī)制,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,Holliday中間體,內(nèi)切酶,ruvC,內(nèi)切酶,ruvC,DNA 連接酶,DNA 連接酶,圖15-6 同源重組機(jī)制,Holliday中

12、間體,工具酶的定義,工具酶：指能用于DNA和RNA分子的切割，連接，聚合，反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng),常 用 的 工 具 酶,工 具 酶 名 稱 主 要 功 能 限制性內(nèi)切核酸酶 在DNA分子內(nèi)部的特異性的 restriction endonucleases 堿基序列內(nèi)部進(jìn)行切割 DNA連接酶 將兩條以上的線性DNA分子或片段 DNA ligase 催化形成磷酸二酯鍵連接成一個(gè)整體 DNA聚合酶I 通過(guò)向3端逐一增加核苷酸以填補(bǔ)雙鏈DNA分子上的單鏈 DNA polymerase I 裂口，即53DNA聚合酶活性與35及53外切酶活性 多核苷酸激酶 催化將把一個(gè)磷酸分子加到多核苷酸鏈的 DNA

13、polymerase kinease 5OH末端上 反轉(zhuǎn)錄酶 以RNA或DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的cDNA鏈 reverse transcriptase DNA末端轉(zhuǎn)移酶 將多聚物尾巴加到了線性雙鏈 DNA terminal Deoxynuc 或單鏈DNA分子的3OH末端或DNA的3末端標(biāo)dNTP leatidy transferase (接下表格,常 用 的 工 具 酶 (續(xù)上表格) 工 具 酶 名 稱 主 要 功 能 堿性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5磷酸基團(tuán) BAP orCIP 核酸外切酶III 降解DNA3OH末端的核苷酸殘基 exonuclease III 降解酶S1 降解單

14、鏈DNA或RNA,產(chǎn)生帶5磷酸的單核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同時(shí)也可切割雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)核酸酶Bal 31 降解雙鏈DNA,RNA的5及3末端， nuclease Bal31 高專一性單鏈核苷酸 Taq DNA 聚合酶 能在高溫（72）下的單鏈DNA為模板， Taq DNA polymerase從53方向合成新生的互補(bǔ)鏈 核糖核酸酶 專一性降解RNA RNase 脫氧核糖核酸酶 內(nèi)切核酸酶，水解單鏈或雙鏈DNA DNase,限制性核酸內(nèi)切酶的分類,按限制性核酸內(nèi)切酶的分解模式，分為三類： 類型I (有識(shí)別位點(diǎn),切割長(zhǎng)短不一而 無(wú)特異性) 類型II(切后IIa含粘性末端

15、Hin(從Haemaphilu influenzae流感嗜血菌中分離出的酶)。 微生物的株和型寫在其后右下角EcoRI 若從某株中分離得數(shù)種酶為HindI.II,III,II型限制性內(nèi)切酶的切割方式,三種切割方式：按切割位點(diǎn)相對(duì)于二重對(duì)稱軸的位置來(lái)區(qū)分： 一種是在對(duì)稱軸5側(cè)切割產(chǎn)生5粘端， 5-NGAATTCN-3 EcoRI 5-NG AATTCN-3 3-NCTTAAGN-5 3-NCTTAA GN-5 5粘端 另一種是在對(duì)稱軸的3側(cè)切割產(chǎn)生3粘端， 5-NCTGCAGN-3 PstI 5-NCTGCA CN-3 3-NGACGTCN-5 3-NG ACGTCN-5 3粘端 第三種切割方式

16、是在對(duì)稱軸處切割，就產(chǎn)生平末端 5-NCCC GGGN-3 SmaI 5-NCCC GGGN-3 3-NGGG CCCN-5 3-NGGG CCCN-5 平端,1.cDNA(complementary DNA):是指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的， 與RNA互補(bǔ)的單鏈DNA。 以單鏈cDNA為模板，可合成雙鏈cDNA。 cDNA文庫(kù)：將mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再?gòu)?fù)制成 雙鏈cDNA，并與適當(dāng)?shù)妮d體重組后 導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這種含有整個(gè)mRNA 信息的集合,2. 基因組DNA（genomic DNA）：指代表一個(gè)細(xì)胞 或生物體整套遺傳信息（染色體 及線粒體）的所有DNA序列。 基因組文庫(kù)：將某種細(xì)胞的基因組DN

17、A切成一 定大小的片段，并與適當(dāng)?shù)妮d體重 組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這種含有整個(gè) 基因組DNA信息的集合,載體特征： 1.能自主復(fù)制；拷貝數(shù)高 2.有篩選標(biāo)記，（如對(duì)抗菌素的抗性，某些基因產(chǎn)物 的顯色反應(yīng)等。）便于重組體的篩選和鑒定。 3.有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)）， 具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱多克隆位點(diǎn) 4.分子量小，能容納較大的外源DNA,1.質(zhì)粒（plasmid） 是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA 分子。大小約為 數(shù)千堿基對(duì)。常 有1 3個(gè)抗藥 性基因，以利于 篩選,質(zhì)粒,圖 15-7 質(zhì)粒 pUC19,396,質(zhì)粒獲得 目的基因,2.噬菌體（phage）DNA 噬菌體DNA改造系統(tǒng)

18、gt 系列（插入型，適用cDNA克?。?EMBL系列（置換型，適用基因組克?。?M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lac Z基因） M13mp系列 pUC系列,二、重組DNA技術(shù)基本原理,粘性末端連接,抗藥性標(biāo)記選擇 （插入失活法）： 將目的基因插入帶ampr和tetr基因載體的tetr基因中，則tetr基因失活。 在分別含有氨芐青霉素和含四環(huán)素的兩個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選,標(biāo)志補(bǔ)救： 若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá) 產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)。 就可利用對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的依賴表型來(lái)篩選,分子雜交法：利用32P標(biāo)記的探針與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素 膜上的轉(zhuǎn)化子DNA或克隆的DNA片段進(jìn)行分 子雜交，直接選擇并鑒定目的基因。 原位雜交 Southern印跡,硝酸纖維膜 菌落 瓊脂培養(yǎng)板,硝酸纖維膜,復(fù)制培養(yǎng),溶菌、中和 蛋白酶處理 漂洗、烘干,1、32P探針 2、