兩種常用纖維素酶活力測定方法-濾紙酶活-CMC酶活

1、檢測纖維素酶酶活力濾紙酶活力(FPA)濾紙酶活力代表了纖維素酶的三種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。采用3，5一二硝基水楊酸法測定酶活：(簡稱DNS法)1、原理：纖維素經纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能將3，5一二硝基水楊酸中硝基還原成氨基，溶液變?yōu)槌壬陌被衔?，即?一氨基一5二硝基水楊酸，在一定的還原糖濃度范圍內，橙色的深度與還原糖的濃度成正比，據(jù)此可以推算出纖維素酶的活力。2、采用的濾紙酶活單位定義：濾紙酶活反映了纖維素酶的3種水解酶，即內切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和葡聚糖苷酶組成的誘導復合酶系的協(xié)同水解纖維素 能力。是該菌株整個纖維素酶系的酶活力水平的綜合體現(xiàn)。代表了纖維素酶的三種酶

2、組分協(xié)同作用后的總酶活。在此濾紙酶活單位定義為：以濾紙為底物，在一定反應條件(pH4.8，50，恒溫lh)下， 以水解反應中，1ml纖維素酶液1min催化纖維素生成lug葡萄糖為1個濾紙酶活單位，以U表示。3、濾紙酶活力(FPA)的測定：1 取05ml適當稀釋的酶液，加入PH值為4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液lml或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液lml；2 再加入500.5mg濾紙(1cmx6cm)一條，于50保溫酶解反應1小時，(先預熱5分鐘)；3 加入DNS顯色液3ml(標準曲線用量是1.5ml)，放入已沸騰的水中沸水浴lOmin，流水冷卻后在540nm下測吸光度；4 同時用100煮

3、沸l(wèi)Omin后失活的酶液做對照，扣除本底；5 根據(jù)吸光度從葡萄糖標準曲線中查出相應的葡萄糖含量，根據(jù)生成的葡萄糖克數(shù)計算出酶活值。濾紙酶活按下面公式計算：X=（WxNxlOOO）（TxM）X:為濾紙酶酶活力，單位UmL。W： 為從葡萄糖標準曲線中查得的葡萄糖的濃度。N： 為酶液稀釋總倍數(shù)。T： 為反應時間。M： 為樣品的體積。4、葡萄糖標準曲線繪制方法標準曲線繪制：取25ml具塞刻度試管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖標準溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS試劑1.5 ml，混勻后在沸水浴中加熱5分鐘

4、，取出立即用冷水冷卻，用水定容至25 ml，搖勻，測吸光度A，以吸光度為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線。5、3，5二硝基水楊酸（DNS）試劑稱取6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸鉀鈉，加500ml水，加熱溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。纖維素酶活力的測定CMC糖化力法1、 定義：1毫升液體酶（或1克固體酶粉），在40 pH4.6條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），產生1.0ug的葡萄糖，即為1個酶活單位，以u/g（u/ml）表示。2、 原理：CMC

5、-Na在纖維素酶的作用下,水解產生纖維寡糖、纖維二糖、葡萄糖等還原糖，還原糖能將3，5二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基化合物，在540nm波長下測定吸光度值A，吸光度與酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表內切-1.4-葡聚糖的活力。3、 試劑：3.1 0.1mol/LpH4.6醋酸醋酸鈉緩沖溶液：將49.0ml0.2mol/L醋酸鈉溶液和51.0ml0.2mol/L醋酸溶液混合后加100ml蒸餾水。注意：0.2molL醋酸鈉溶液：稱取27.22g結晶乙酸鈉（AR）定容至1000ml。 0.2molL醋酸溶液：稱取冰乙酸（AR）11.5ml定容至1000ml。3.2 3，5二硝基水楊酸（

6、DNS）試劑：稱取6.3克3,5-二硝基水楊酸用水溶解，加入21.0克NaOH，182克酒石酸鉀鈉，加500ml水，加熱溶解后再加入5.0克重蒸酚和5.0克亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻，定容至1000ml，存于棕色瓶中，放置7天后使用。3.3 葡萄糖標準溶液（1.0mg /ml）：稱取1.000克葡萄糖（AR）(105干燥至恒重)用蒸餾水溶解后定容至1000ml，冰箱保存?zhèn)溆谩?.4 羧甲基纖維素鈉溶液：稱2.0gCMC-Na溶于200 ml蒸餾水中，加醋酸緩沖溶液100 ml,混勻后存于冰箱內備用。配后隔天使用。4、 分析步驟：4.1標準曲線繪制：取25ml具塞刻度試管6支，加入1.0 mg /

7、ml的葡萄糖標準溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸餾水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS試劑1.5 ml，混勻后在沸水浴中加熱5分鐘，取出立即用冷水冷卻，用水定容至25 ml，搖勻，測吸光度A，以吸光度為縱坐標，葡萄糖的含量為橫坐標，繪制標準曲線。4.2 待測酶液制備：準確稱取酶粉1.0克置研缽中，加入pH4.6的醋酸緩沖溶液少量溶解，研細，將上清液小心傾入25ml刻度試管中，沉渣再加入少量緩沖液,如此搗研3-4次，最后全部移入試管中并定容至25ml，搖勻，過濾，濾液待測。4.3 測定：取1.5mlCMC-Na溶液與0.5ml適當稀釋的酶液于25ml試管中，40水浴保溫30min后立即加1.5mlDNS顯色劑，沸水浴煮沸5min，取出立即冷卻，用水定容25ml，在540nm測吸光度As?？瞻讟樱合燃?.5mlDNS試劑，后加0.5ml待測酶液，與1.5mlCMC-Na溶液，于25ml試管中，沸水浴煮沸5min，冷卻后用水定容25ml，在540nm測吸光度Ac