微生物鑒定中的生理生化試驗(yàn)

1、.微生物鑒定中的生理生化試驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 證明不同微生物對(duì)各種有機(jī)大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。2. 掌握進(jìn)行微生物大分子物質(zhì)水解試驗(yàn)的原理和方法。3. 了解糖發(fā)酵的原理，掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。4. 了解吲哚和甲基紅試驗(yàn)的原理以及其在腸道細(xì)菌鑒定中的意義和方法。二實(shí)驗(yàn)原理由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應(yīng)來鑒別不同的細(xì)菌，尤其是在腸桿菌科細(xì)菌的鑒定中，生理生化試驗(yàn)占有重要的地位。具體的原理如下：1. 大分子水解試驗(yàn)微生物對(duì)大分子物質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不

2、能直接利用，必須依靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解后，才能被微生物利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大分子物質(zhì)為較小化合物，使其能被運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，脂肪酶水解脂肪為甘油和脂肪酸，蛋白酶水解蛋白質(zhì)為氨基酸等，這些過程均可通過觀察細(xì)菌菌落周圍的物質(zhì)變化來證實(shí)。如淀粉遇碘液會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色，但細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘液測(cè)定時(shí)，不再產(chǎn)生藍(lán)色，表明細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶。脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸可改變培養(yǎng)基的pH，使pH降低，加入培養(yǎng)基的中性紅指示劑會(huì)使培養(yǎng)基從淡紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樯罴t色，說明細(xì)胞外存在脂肪酶。2. 糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤

3、為重要，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源，但是它們?cè)诜纸馓穷愇镔|(zhì)的能力上有很大的差異，有些細(xì)菌能分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫氣、加完、二氧化碳等），有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如，大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；普通變形桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。發(fā)酵培養(yǎng)基含有蛋白胨、指示劑（溴甲酚紫）、倒置的德漢氏小管和不同的糖類。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，溴甲酚紫指示劑可由紫色（pH6.8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5.2）。氣體的產(chǎn)生可由倒置的德漢氏小管中有無氣泡來證明。3IMViC試驗(yàn)IMViC是吲哚（indol）、甲基紅（methyl

4、red test）、伏-普（Voges-Prokauer test）和檸檬酸鹽（citrate test）四個(gè)實(shí)驗(yàn)的縮寫，主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌，多用于水細(xì)菌學(xué)檢查。硫化氫試驗(yàn)也是檢查腸道桿菌的生化試驗(yàn)。大腸桿菌雖非致病菌，但在飲用水中超過一定數(shù)量，則表示受糞便污染，產(chǎn)氣腸桿菌也廣泛存在于自然界中，因此檢查水時(shí)要將兩者分開。吲哚試驗(yàn)是用于檢測(cè)吲哚的產(chǎn)生，某些細(xì)菌可產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。對(duì)二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚（紅色）。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，因此吲哚試驗(yàn)可以作為一個(gè)生物化學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)。色氨酸水解反應(yīng)：吲哚與對(duì)二甲

5、基氨基苯甲醛反應(yīng)：大腸桿菌吲哚反應(yīng)陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。甲基紅試驗(yàn)是用來檢測(cè)由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。當(dāng)細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色（pH6.3）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（pH4.2），即甲基紅反應(yīng)。盡管所有的腸道微生物都能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸，但這個(gè)試驗(yàn)在區(qū)分大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌上仍然是有價(jià)值的。這兩個(gè)細(xì)菌在培養(yǎng)的早期均產(chǎn)生有機(jī)酸，但大腸桿菌在培養(yǎng)后期仍能維持酸性pH4，而產(chǎn)氣腸桿菌則轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大約6，因此，大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。三實(shí)驗(yàn)器材1. 菌種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球

6、菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌。2. 培養(yǎng)基和試劑（1）培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗(yàn)）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵試驗(yàn)）；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。（2）溶液和試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、中性紅試劑等。3. 儀器及其它用品酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿、試管、燒杯、量筒、德漢氏小管、無菌操作臺(tái)等。四操作步驟1. 培養(yǎng)基的配制及滅菌按附錄所示配方稱量各組分，配制培養(yǎng)基（注意：在配置油脂培養(yǎng)基時(shí)不能使用變質(zhì)油，油和瓊脂及水先加熱，調(diào)好PH后最后加入中性紅；在配置糖發(fā)酵

7、培養(yǎng)基時(shí)將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基（PH7.6）以及糖溶液分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管，使之充滿培養(yǎng)基）。配制分裝包扎完成后放入滅菌鍋中113滅菌20min。2. 倒平板，接種及培養(yǎng)（1）淀粉水解試驗(yàn) 倒平板：無菌條件下將冷卻至50下的淀粉培養(yǎng)基倒平板并冷卻至室溫。 接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分，并標(biāo)記各分區(qū)所接種的名稱。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在所標(biāo)定對(duì)應(yīng)的不同的區(qū)域點(diǎn)種（注：由于四種菌對(duì)淀粉的水解程度不同，為防止由于接種量過大導(dǎo)致四種菌對(duì)應(yīng)區(qū)域水解部位發(fā)生重疊，宜采用點(diǎn)種的方式，如下圖1）。接種完成貼好標(biāo)簽后在37條件下培養(yǎng)兩天

8、。圖 2油脂水解試驗(yàn)接種示意圖圖 1淀粉水解試驗(yàn)接種示意圖（2）油脂水解試驗(yàn) 倒平板：無菌條件下將冷卻至50下的油脂培養(yǎng)基倒平板并冷卻至室溫（注：倒平板時(shí)，需不斷攪拌，使油均勻分布于培養(yǎng)基中）； 接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在平板底部劃成四部分，并標(biāo)記各分區(qū)所接種的名稱。將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在所標(biāo)定對(duì)應(yīng)的不同的區(qū)域劃十字線接種（如上圖2所示）。接種完成貼好標(biāo)簽后在37條件下培養(yǎng)兩天。（3）糖酵解試驗(yàn) 葡萄糖酵解的接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名（大腸桿菌，普通變形桿菌）。取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管5支，按編號(hào)2支接種大腸桿菌，

9、2支接種普通變形桿菌，剩余的1支作為空白對(duì)照不接種。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。 乳糖酵解的接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的菌名（大腸桿菌，普通變形桿菌）。取盛有乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管5支，按編號(hào)2支接種大腸桿菌，2支接種普通變形桿菌，剩余的1支作為空白對(duì)照不接種。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。（4）IMViC試驗(yàn) 吲哚實(shí)驗(yàn)的接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在各試管上標(biāo)明所接種的菌名。取盛有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管4支，按編號(hào)2支接種大腸桿菌，另2支接種產(chǎn)氣腸桿菌。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。 甲基紅實(shí)驗(yàn)的接種及培養(yǎng)：用記號(hào)筆在各試管上標(biāo)明所接種的菌名。取盛有葡萄糖蛋白胨

10、水培養(yǎng)基的試管4支，按編號(hào)2支接種大腸桿菌，另2支接種產(chǎn)氣腸桿菌。接種完成后在37條件下培養(yǎng)兩天。3. 結(jié)果的檢驗(yàn)（1）大分子水解試驗(yàn)的檢驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn)的檢驗(yàn)：觀察各種細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，打開平板的蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板，觀察水解圈，出現(xiàn)水解圈的為陽性，記錄試驗(yàn)結(jié)果。 油脂水解試驗(yàn)的檢驗(yàn)：取出平板，觀察各種細(xì)菌產(chǎn)生的菌苔顏色，出現(xiàn)紅色菌苔的為陽性，記錄試驗(yàn)結(jié)果。（2）糖發(fā)酵試驗(yàn)的檢驗(yàn)：取出各試管，與空白對(duì)照組對(duì)照觀察培養(yǎng)基的顏色以及倒立的小管中氣泡的有無，若培養(yǎng)基變成黃色則說明細(xì)菌分解糖類并產(chǎn)酸；若倒立的小管中有氣泡存在，則說明細(xì)菌分解糖類并產(chǎn)氣。

11、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的為陽性。（3）IMViC試驗(yàn)的檢驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)的檢驗(yàn)：取出各試管，向培養(yǎng)基中加入34滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性。 甲基紅試驗(yàn)的檢驗(yàn)：取出各試管，向培養(yǎng)基的培養(yǎng)物內(nèi)加甲基紅試劑2滴。培養(yǎng)基變黃為陰性，紅為陽性。五 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（理論實(shí)驗(yàn)結(jié)果）A大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)（1） 淀粉水解試驗(yàn)（我們的實(shí)驗(yàn)也得到了預(yù)期的結(jié)果）表1 淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌+可以水解淀粉枯草芽孢桿菌+可以水解淀粉金黃色葡萄球菌-不可以水解淀粉銅綠假單胞菌-不可以水

12、解淀粉（2） 油脂水解試驗(yàn)表2 油脂水解試驗(yàn)(“+”表示陽性，“”表示陰性)菌種陰 / 陽性結(jié)論大腸桿菌-不可以水解油脂枯草芽孢桿菌-不可以水解油脂金黃色葡萄球菌-不以水解油脂銅綠假單胞菌+可以水解油脂B. 糖發(fā)酵試驗(yàn)（1） 葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)表3 葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色變化黃色黃色紫色是否產(chǎn)氣是是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌能分解葡萄糖，同時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣。對(duì)照組（2） 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)表4 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌普通變形桿菌空白顏色變化紫色紫色紫色是否產(chǎn)氣否否否陰/陽性-結(jié)論

13、大腸桿菌不能分解乳糖，故不產(chǎn)酸產(chǎn)氣。普通變形桿菌不能分解乳糖，故不產(chǎn)酸不氣。對(duì)照組C. IMViC試驗(yàn)（1） 吲哚試驗(yàn)表5 吲哚試驗(yàn)（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌是否產(chǎn)生紅色環(huán)狀物是否陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌可以分解色氨酸為吲哚產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚（2） 甲基紅試驗(yàn)表6 甲基紅試驗(yàn)（“+”表示陽性，“”表示陰性）樣品大腸桿菌產(chǎn)氣腸桿菌顏色變化變紅變黃陰/陽性+-結(jié)論大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH產(chǎn)氣腸桿菌轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析理想上的試驗(yàn)結(jié)果如上述表格所示，但是我們組的實(shí)驗(yàn)只有淀粉水解試驗(yàn)是成功的，其他的是失敗的。其中由淀粉水解試驗(yàn)可以得

14、出枯草芽孢桿菌和大腸桿菌能產(chǎn)生淀粉酶的結(jié)論，枯草芽孢桿菌菌落周圍的透明圈較大腸桿菌周圍的透明圈大，可以大體判斷前者較后者代謝利用淀粉的能力強(qiáng)。通過油脂水解試驗(yàn)，理想上的結(jié)果是銅綠假單胞菌能產(chǎn)生脂肪酶分解脂肪從而出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)狀菌苔，但可能是培養(yǎng)基的原因，我們的實(shí)驗(yàn)失敗了。通過糖酵解實(shí)驗(yàn)，理想結(jié)果應(yīng)為大腸桿菌和普通變形菌都能夠分解葡萄糖，但是普通變形菌不能夠分解乳糖。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻是普通變形菌不能分解乳糖，與事實(shí)相違背，實(shí)驗(yàn)失敗。究其原因可能是菌種在接種時(shí)出現(xiàn)失誤而接種失敗或是菌種本身存在有問題，還有可能是接種量太少，培養(yǎng)時(shí)間不夠等原因。在吲哚試驗(yàn)中，理想結(jié)果是大腸桿菌具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，

15、而產(chǎn)氣腸桿菌不能分解色氨酸為吲哚。在甲基紅實(shí)驗(yàn)中，理論上是大腸桿菌在培養(yǎng)期仍維持酸性pH，產(chǎn)氣腸桿菌轉(zhuǎn)化有機(jī)酸為非酸性末端產(chǎn)物，我們的實(shí)驗(yàn)也失敗了，試驗(yàn)失敗有可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基配錯(cuò)或菌種的原因。六 注意事項(xiàng)1. 淀粉水解試驗(yàn)中，觀察各種細(xì)菌生長(zhǎng)情況時(shí)，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，應(yīng)輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。2. 油脂水解試驗(yàn)中，制備固體油脂培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)充分搖蕩，使油脂均勻分布。3. 接種前要用記號(hào)筆做好標(biāo)記，接種時(shí)要對(duì)號(hào)接種。4. 糖發(fā)酵試驗(yàn)中，接種后要輕緩搖動(dòng)試管，使其均勻，防止倒置的小管進(jìn)入氣泡。否則會(huì)造成假象，得出錯(cuò)誤的結(jié)果。5. 吲哚試驗(yàn)中，注意加入34滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置

16、1min，待乙醚上升后，再沿試管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。否則就會(huì)觀察不到在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生的紅色環(huán)狀物。6. 甲基紅試驗(yàn)中，應(yīng)該注意甲基紅試劑不要加得太多，以免出現(xiàn)假陽性。七思考題1. 你怎么樣解釋淀粉酶是胞外酶而非胞內(nèi)酶？答：菌苔周圍產(chǎn)生水解圈，可知淀粉在細(xì)胞外被水解，應(yīng)該是細(xì)菌將淀粉酶分泌到胞外所致，因此為胞外酶。2. 不利用碘液，你怎樣證明淀粉水解的存在？答：淀粉水解為葡萄糖才能被細(xì)胞利用，因此可以換用斐林試劑。呈陽性者則說明產(chǎn)生了葡萄糖，淀粉被水解；陰性者說明淀粉未被水解。3. 假如某種微生物可以有氧代謝葡萄糖，發(fā)酵試驗(yàn)應(yīng)該出現(xiàn)什么結(jié)果？答：由于產(chǎn)生的CO2溶于水的量少且碳酸酸性若

17、，因此顏色不變化，仍為紫色。德漢氏小管中有氣柱。4. 討論IMViC試驗(yàn)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上的意義。答：可以鑒別某些疾病是由大腸桿菌還是產(chǎn)氣腸桿菌引起的。5. 解釋在細(xì)菌培養(yǎng)中吲哚檢測(cè)的化學(xué)原理，為什么在這個(gè)試驗(yàn)中用吲哚的存在作為色氨酸酶活性的指示劑，而不用丙酮酸？答：某些細(xì)菌可產(chǎn)生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。對(duì)二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是紅色物質(zhì)，便于觀察。附錄 實(shí)驗(yàn)中用到的各種培養(yǎng)基配方1 固體淀粉培養(yǎng)基蛋白胨 10gNaCl 5g牛肉膏 5g可溶性淀粉 2g蒸餾水 1000mL瓊脂 1520g121滅菌20min。2 固體油脂培養(yǎng)基蛋白胨 10g牛肉膏 5gNaCl 5g香油或花生油 10g1.6%中性紅水溶液 1mL瓊脂 1520g蒸餾水 1000mLpH 7.2121滅菌20min。注：（1）不能使用變質(zhì)油。（2）油和瓊脂及水先加熱。（3）調(diào)好pH后再加入中性紅。（4）分裝時(shí)，需不斷攪拌，使油均勻分布于培養(yǎng)基中。3. 葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)蛋白胨水培養(yǎng)基 1000mL NaCl 5g葡萄糖 12.