《豬血清白蛋白的分》參考PPT

1、血清白蛋白的分離、純化與鑒定,血清白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占總量的60。 它是一種水溶性很強的蛋白，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能結(jié)合多種小分子，如脂肪酸，膽紅素，血紅素等，起維持血液的正常滲透壓作用。 此外白蛋白還有解毒、參與脂類代謝及血漿中微溶物質(zhì)的運輸、維持血液酸堿平衡等作用，在醫(yī)學(xué)臨床及生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,實驗?zāi)康?掌握血液樣品的正確處理和制備方法 掌握血清白蛋白粗分離的一般方法 掌握離子交換法分離純化蛋白質(zhì) 掌握蛋白質(zhì)純度檢測的方法 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量的原理和方法 學(xué)會考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量,原理與操作,血清的制備,白蛋白的分離,白蛋白的純化,蛋白質(zhì)含量的 測

2、定,白蛋白純度的檢測,白蛋白的相對分子質(zhì)量的測定,留樣：2，3,留樣：4,留樣：1,一、血清白蛋白的分離,1 采血 2 血清分離 3 鹽析法分離血清白蛋白 4 除鹽,收集血清： 取2 mL血液，4 ，3,000 rpm 離心15 min，用移液槍吸取上清（血清）1 mL至10 mL離心管；留0.1mL（樣1）至1.5 mL離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳,鹽析：中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過程。 中性鹽并不破壞蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，因此，除去中性鹽或減低鹽的濃度，蛋白質(zhì)就會重新溶解。 分級鹽析實現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離純化。 在血清中加入硫酸銨，當飽和度為50%時，血清白蛋白不沉淀，球蛋白析出，飽和度

3、達55%，白蛋白析出,量筒量取9 ml底液（50 %的飽和硫酸銨溶液），用移液管逐滴加入，不斷搖晃。4 靜置2 h； 4 ，13,000 rpm離心20 min，收集上清，留0.5 ml（樣2）至1.5 ml離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳,用5%的檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4.5，用量筒確定上清液的體積，計算加入飽和硫酸銨（pH4.5）的體積（0.11V）； 逐滴加入飽和硫酸銨（pH4.5），振蕩，4 靜置2 h； 4 ，3,000 rpm離心20 min，棄上清，沉淀用0.5 mL pH7.4的檸檬酸緩沖液溶解，置透析袋中，放入pH 7.4的檸檬酸緩沖液中，攪拌透析過夜至蛋白質(zhì)溶液中無NH4存

4、在；留0.1 ml（樣3）至1.5 ml離心管，用于測定蛋白質(zhì)含量和電泳； NH4的檢測：奈氏試劑,奈氏反應(yīng),奈氏試劑是絡(luò)鹽K2HgI4加KOH的溶液，在無機化學(xué)定性分析中，用其檢驗氨或銨鹽,磚紅色的溶液或沉淀,二、血清白蛋白的純化,離子交換柱層析： 離子交換柱的安裝 平衡 加樣 洗脫 樣品收集,在離子交換層析中，蛋白質(zhì)對離子交換劑的結(jié)合力取決于彼此之間的靜電吸引。 蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐宣}離子濃度或pH來完成，對離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首先從層析柱中洗脫出來。 本實驗采用的DEAE纖維素離子交換劑,層析洗脫，可以采用保持洗脫液成分一直不變的方式洗脫，也可采用改變洗脫的鹽濃度和

5、（或）pH的方式洗脫，后一種方式又可以分為兩種：一種是跳躍式的分段改變（梯度洗脫），另一種是漸進式的連續(xù)改變（連續(xù)洗脫,除硫酸銨后的白蛋白溶液在0.02mol/L pH7.4 醋酸銨緩沖液的條件下，加到二乙氨乙基（DEAE ）一纖維素層析柱上，在此pH 時，DEAE -纖維素帶有正電荷，它能吸附帶負電荷的白蛋白、及球蛋白（血清白蛋白等電點為4 . 9 ，絕大多數(shù)。及球蛋白等電點均小于6 ）。隨著鹽離子濃度的提高，離子交換柱上的球蛋白、球蛋白、白蛋白依次被洗脫下來,DEAE-纖維素離子交換層析： 裝柱：將層析柱垂直固定。將DEAE-纖維素裝入柱內(nèi)，至8-10cm高度，平衡過夜； 洗脫液流速調(diào)節(jié)為

6、 1mL/min； 上樣：將透析袋剪開，用移液管轉(zhuǎn)至層析柱內(nèi)，待樣品進入凝膠后再加入少量緩沖液，使樣品完全進入膠內(nèi)； 洗脫：采用連續(xù)梯度洗脫，用0.021.0molL醋酸醋酸銨緩沖液（pH7.4）進行洗脫，收集； 記錄出現(xiàn)峰值的管號(樣品4,) 洗脫速度慢，可直接換B液（ 1.0molL醋酸醋酸銨緩沖液,五、血清白蛋白的相對分子質(zhì)量測定 -SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳遷移率與顆粒的電荷、形狀、大小（分子量）有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān),SDS的作用：1.能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑（巰基乙醇）能使二硫鍵斷裂，使蛋白質(zhì)完全變性；2.能

7、與變性的蛋白質(zhì)按比例結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的特點：1. 由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)；2.復(fù)合物都是橢圓棒狀。 因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子量大小,測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標，lgMW為縱坐標作標準曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標準曲線上查出它們的lgMW，再換算成蛋白質(zhì)分子量,測定各條帶的相對遷移率，根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對遷移率，以相對遷移率為橫坐標為lgMW為縱坐標作標準曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對遷移率從標準曲線上查出它們的lgMW，再換算成蛋白

8、質(zhì)分子量,在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-Bx（MW為分子量，X為遷移率，k、B均為常數(shù)） 若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量,計算豬血白蛋白的分子量 ：logMW=K-Bx,膠的制備,樣品的處理 向標準蛋白質(zhì)或待測樣品中按比例加入上樣緩沖液，充分溶解后，加蓋（不要密閉），置沸水浴3 min，取出冷至室溫。 上樣順序：標準蛋白；樣品1；樣品2；樣品3；柱層析高峰管號的蛋白質(zhì)樣品4,； 加樣量：20L,電泳：點樣端負極，恒壓：開始80V

9、，待樣品進入分離膠后120V。 電極緩沖液：pH 8.3 Tris Gly 染色：脫色考馬斯亮蘭R-250，過夜。 脫色：先用蒸餾水沖洗凝膠，再用脫色液（冰醋酸：蒸餾水：甲醇=75：875：50）脫色1-3h,四、考馬斯亮蘭法測定蛋白質(zhì)含量 考馬斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm。當它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時呈藍色，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm，考馬斯亮藍G250 -蛋白質(zhì)復(fù)合物的高消光效應(yīng)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)定量測定的高敏感度. 在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮藍G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈色后，在595nm 下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)濃度的測定,操作 （mL,標準蛋白液：50g/ mL；樣1、2、3稀釋100倍 樣1稀釋600倍（10 l6ml）；樣2、3稀釋200倍（10 l2ml）；各峰稀釋5-10倍（10 l6ml,按上表加好試劑后搖勻，以0管為對照，于595nm處測定光吸收值，以管做出標準曲線；各樣品的光吸收值，取平均值，從標準曲線中查出蛋白質(zhì)的g數(shù),三、血清白蛋白純度的檢測,聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法,A、膠的制備,B 加樣：各步驟留樣的樣液；層析后的蛋白峰。 樣品的處理：樣品加等量的40%蔗糖溶液、一滴0