α淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測課件

1、淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,實(shí)驗6 -淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,酶作為生物催化劑,具有專一性和高效性.現(xiàn)在被大量使用在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而，在應(yīng)用酶的過程中，人們也發(fā)現(xiàn)了一些實(shí)際問題： （1）不穩(wěn)定：酶通常對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫和有機(jī)溶劑等條件非常敏感，容易失活； （2）不利于工業(yè)化使用：溶液中的酶很難回收，提高了生產(chǎn)成本，也可能影響產(chǎn)品質(zhì)量,怎樣解決這些問題呢,固定化酶技術(shù),淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,一、酶與固定化酶,酶 固定化酶 (固相酶,活細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物催化作用的生物大分子,將水溶性的酶用物理或化學(xué)的方法固定在某種介

2、質(zhì)上，使之成為不溶于水而又有酶活性的制劑,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,固定化酶的優(yōu)點(diǎn),1）使酶固定化后有一定的機(jī)械強(qiáng)度，催化反應(yīng)的過程可管道化、連續(xù)化和自動化； （2）酶不溶解在催化反應(yīng)的溶液中，產(chǎn)物更易純化； （3）固定化酶可反復(fù)使用，更經(jīng)濟(jì)，更利于工廠化生產(chǎn)； （4）固定化酶提高了酶的穩(wěn)定性，可較長時間貯存和使用,固定化酶的不足之處,不能催化一系列反應(yīng),淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,二、酶的固定化,機(jī)理： 將固定化酶裝柱，當(dāng)?shù)孜锝?jīng)過該柱時，在酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物,方法： 吸附法 包埋法 共價偶聯(lián)法 交聯(lián)法,目的,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,一)、吸附法 吸附法是將酶與

3、吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡單的固定化技術(shù)，在經(jīng)濟(jì)上也最具有吸引力,1、根據(jù)吸附劑的特點(diǎn)分為兩種,物理吸附法,離子結(jié)合法,通過氫鍵、疏水鍵等作用力將酶吸附于固體吸附劑的方法.如有機(jī)硅膠、活性炭和石英砂等,利用酶的兩性基團(tuán)和離子交換劑的相互作用（離子鍵）。吸附量大,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,二）、包埋法,將酶包埋在多孔的載體中，包埋成格子型或包埋成微膠囊型,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,是目前研究中最為活躍的方法。它的原理是酶蛋白的一些基團(tuán)，在溫和的條件下與載體共價結(jié)合，形成共價鍵，從而被固定化,三）共價偶聯(lián)法,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,是

4、酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵及酶蛋白的氨基相連得到三維的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),四）、交聯(lián)法,氨基相連處,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,酶,物理吸附法,交聯(lián)法,包埋法,酶的固定化方法,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,固定化酶的性質(zhì),穩(wěn)定性增加： 對熱、蛋白酶及各種試劑的穩(wěn)定性,pH活性曲線和最適pH的變化： 可能向酸性或堿性方向移動。需實(shí)驗確定,底物的專一性變化,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,三、-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用檢測的實(shí)驗,1、實(shí)驗?zāi)康模?（1）制備固定化-淀粉酶； （2）進(jìn)行淀粉水解的測定,2、實(shí)驗原理： 用吸附法將-淀粉酶固定在石英砂上。一定濃度的淀粉溶液經(jīng)過固定化

5、酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示劑溶液（KII2）測試，流出物呈紅色，表明水解產(chǎn)物糊精生成,枯草桿菌的-淀粉酶： 最適pH5.57.5 最適溫度5575,淀粉,糊精,麥芽糖,葡萄糖,淀粉酶,淀粉酶,糖化淀粉酶,遇碘顯藍(lán)色 遇碘顯紅色 遇碘不顯色,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,3、設(shè)備及用品： 5ml塑料注射器、50ml燒杯、滴管、自行車用氣門芯及夾子、注射器架、試管或微量離心管3支,4、實(shí)驗材料及其制備 （1） -淀粉酶的固定化： （2）可溶性淀粉溶液： （3）5mmol/L KI-I2溶液,5mg-淀粉酶+4ml蒸餾水+5g石英砂，攪拌，30min 裝入層析柱10倍體積的蒸餾水洗

6、滌此注射器，流速為1ml/min（約20滴,50mg可溶性淀粉溶于100ml熱水中，攪拌均勻,0.127g碘+0.83g碘化鉀+蒸餾水100ml,完全溶解后裝入滴瓶中,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,5、實(shí)驗步驟,將注射器固定在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液，流速0.3ml/min，（盡量慢,流出5ml后接收0.5ml（約10滴）流出液,加入12滴KI-I2溶液，觀察顏色,用水稀釋1倍后再觀察顏色（與對照組比較,實(shí)驗后，10倍柱體積蒸餾水洗滌此柱，放置在4冰箱中,幾天后重復(fù)實(shí)驗，觀察結(jié)果,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,淀粉溶液+指示劑： 親和層析洗脫液+指示劑： 貯于冰箱幾天后重復(fù)實(shí)

7、驗,6、實(shí)驗結(jié)果,呈藍(lán)色,呈紅色,呈紅色,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,固定化酶的用途,在工業(yè)上的應(yīng)用： 柚苷酶固定化酶用于果汁脫苦； 木瓜蛋白酶固定化酶用于啤酒澄清； 葡萄糖異構(gòu)酶固定化酶用于制造果糖，提高甜度,在化學(xué)分析和臨床診斷上的應(yīng)用： 用脲酶固定化酶測定血液或尿中的尿素含量,在醫(yī)藥上的應(yīng)用： 將苯丙氨酸羥化酶及其輔酶制成不溶酶，注射到患者體內(nèi)，可有效治療苯丙酮尿癥。 缺少乳糖酶，不能水解牛乳中的乳糖，引起腹痛腹瀉，可用乳糖酶固相酶在體內(nèi)或體外水解乳糖,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,1、試驗中為什么要待固定化酶柱中流出5ml液體后再接收流出液用于鑒定,討論,答案：因為固定化

8、酶柱中的酶與流經(jīng)柱子的淀粉反應(yīng)需要一定的時間，剛開始流出的液體中由于反應(yīng)時間過短，糊精未生成或生成的量太少，所以不利于后面的顏色鑒定,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,2、如何證明洗滌固定化淀粉酶柱的流出液中沒有淀粉酶,答案：可在試管中加入1ml可溶性淀粉溶液，再加入幾滴淀粉酶柱的流出液，混合后用手握住試管增加溫度，幾分鐘后加入1滴KI-I2指示劑，如仍顯藍(lán)色，即流出液中沒有淀粉酶了。 用固定在石英砂的淀粉酶柱再作用于淀粉溶液，使其自柱中流出，作用的結(jié)果才能表明是淀粉酶的固相酶作用的結(jié)果,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,3、耐高溫的淀粉酶有哪些可能的用途,答案：在實(shí)際生產(chǎn)中，總希望反應(yīng)的

9、時間越短越好，這就要提高反應(yīng)溫度。通常生產(chǎn)上淀粉酶是一次性使用的，加溫雖在短時間內(nèi)會使酶變性失活，但只要使淀粉在短時間內(nèi)水解即可。 尋找耐高溫的淀粉酶的目的是在高溫下使淀粉水解快，而且酶不會因高溫而在短時間內(nèi)變性。在發(fā)酵生產(chǎn)中使用的往往是植物淀粉，如青霉素發(fā)酵、乙醇發(fā)酵等都要水解淀粉，所以耐高溫淀粉酶用途廣泛,淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測,1、pH：影響載體和酶的電荷變化,從而影響酶吸附。 2、離子強(qiáng)度：多方面的影響，一般認(rèn)為鹽阻止吸附。 3. 蛋白質(zhì)濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質(zhì)濃度 增加，吸附量也增加，直至飽和。 4. 溫度：蛋白質(zhì)往往是隨溫度上升而減少吸附。 5. 吸附速度：蛋白質(zhì)在固體載體上的