實驗三葉綠體的分離提取觀察

1、實驗三 葉綠體的分離、提取、觀察2011.03.23班級： 姓名：一試驗?zāi)康? 學(xué)習(xí)使用差速離心方法分離獲取葉綠體。2 理解葉綠體的分離與保存環(huán)境。3 葉綠體的形態(tài)觀察、測量、葉綠體懸液的熒光現(xiàn)象觀察。二實驗原理1 葉綠體是植物葉肉細胞內(nèi)重要的細胞器，是植物光合作用的場所。分離提取得到的活體葉綠體，既能進行光合作用速率測定，也能進行葉綠體色素的分離提取。2 差速離心法常用于獲取細胞中的某一物質(zhì)，其原理是在一定轉(zhuǎn)速條件下，不同密度大小的物質(zhì)沉降速度不一樣，最終使有密度差異的物質(zhì)得以分離。三實驗用具1 材料與試劑：菠菜葉、0.35mol/L NaCL、95%乙醇、石英砂。2 器具：離心機、天平、量

2、筒、研缽、玻棒、紗布等四實驗步驟1選用生長健壯的菠菜葉片洗凈后去除中脈，然后放入04 冰箱或冰瓶中預(yù)冷。2取葉片經(jīng)濾紙吸干水后，稱取5g剪成碎片，于1015 mL0.35mol/L氯化鈉溶液中，置于研缽中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力過猛，也不必研磨過細)。3研磨后將勻漿用2層新紗布過濾，濾液盛于燒杯中。4將濾液裝入預(yù)冷過的離心管，經(jīng)天平平衡后，以1200r/min離心2min，棄去沉淀。5上清液再經(jīng)3000 r/min離心 5 min ，傾去上清液，沉淀即為葉綠體。6沉淀用2 mL 0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮，備用。7用滴管取少量懸浮液于載玻片上，加蓋玻片后，吸水紙吸去多

3、余的溶液，置顯微鏡下鏡檢觀察?？煽吹饺~綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。測量葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。8稱取葉片5g剪成碎片，加1015 mL95%乙醇及少量石英砂，于研缽中快速研磨，然后2層紗布過濾，取濾液，將其裝入離心管，以2500r/min離心3min，收集上清液于試管中。9葉綠體熒光現(xiàn)象的觀察：用強的柱狀光源照射盛裝葉綠素提取液的試管，然后順著光源方向觀察提取液顏色，并和對著光管觀察是的情況進行比較。五實驗結(jié)論與思考1 兩次離心的沉淀物顏色有什么不同？過濾的濾渣和第一次離心棄去的沉淀有那些主要成分？2 0.35mol

4、/L NaCL溶液的作用是什么？能否將其用蒸餾水代替？3 實驗用品冷凍以及實驗操作在冰浴中進行的目的是什么？離心機使用注意事項：（1）離心管必須等量、對稱放入套管中，防止機身振動，若只有一支樣品管另外一支要用等質(zhì)量的水代替。（2）啟動離心機時，應(yīng)蓋上離心機頂蓋后，方可慢慢啟動。（3）電動離心機如有噪音或機身振動時，應(yīng)立即切斷電源，即時排除故障。（4）分離結(jié)束后，先關(guān)閉離心機，在離心機停止轉(zhuǎn)動后，方可打開離心機蓋，取出樣品，不可用外力強制其停止運動。背景知識：組織細胞的破碎方法很多，有破碎技術(shù)中細胞破碎法包括機械法（研磨法、勻漿法、膠體磨法）和非機械法（超聲波法、有機溶法、溶脹法、酶解法）。除了

5、某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外，對于細胞內(nèi)或多細胞生物組織中的各種生物大分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同。有些分離方法使用了劇烈的勻漿技術(shù)，例如通過研磨破壞細胞壁讓葉綠體釋放到溶液中，然后通過差速離心分離葉綠體。也可用纖維素酶或果膠酶水解細胞壁獲得原生質(zhì)體，再用溫和的方法破壞細胞質(zhì)膜，然后通過離心分離葉綠體。用劇烈方法分離的葉綠體能夠在光誘導(dǎo)下產(chǎn)生氧、ATP、NADPH、但是不能固定CO2。在電子顯微鏡下觀察這種有缺陷的葉綠體，發(fā)現(xiàn)它含有很少或

6、者根本沒有葉綠體基質(zhì)，并且葉綠體外被是破損的或者沒有外被,將這種葉綠體稱為型葉綠體。相比之下，用溫和方法分離的葉綠體具有完整的被膜，將它稱為型葉綠體，它能夠完成整個光合作用，包括CO2的固定。 可以用型或型葉綠體作為分離葉綠體各組分的出發(fā)材料，常用型葉綠體分離葉綠體的亞組分。將葉綠體懸浮在低滲溶液中，破裂外被，接著用等密度離心分離葉綠體基質(zhì)、外被、類囊體。如果用型葉綠體作為分離葉綠體亞組分的出發(fā)材料，需要弗氏細胞壓碎器(French pressure cell), 分離到組成葉綠體的亞組分之后，便可對這些組分化學(xué)組成和功能進行分析。實驗流程見圖8E-1。圖 葉綠體各組分的分離用溫和勻漿技術(shù)分離

7、型葉綠體,這種類型的葉綠體保留完整的被膜。然后在低滲條件下破壞葉綠體,使葉綠體的膜、葉綠體基質(zhì)、類囊體相互分開。 葉綠素的熒光現(xiàn)象：指葉綠素在透射光下為綠色，而在反射光下為紅色的現(xiàn)象，這紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。葉綠素分子吸收光量子得到能量后，從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。葉綠素分子吸收紅光后，電子躍遷到最低激發(fā)態(tài)；吸收藍光后，電子躍遷到比吸收紅光更高的能級（較高激發(fā)態(tài)）。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，通過振動向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)。處于較低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過幾種途徑釋放能量回到穩(wěn)定的基態(tài)。1）重新放出一個光子，回到基態(tài)，即產(chǎn)生熒光。2）不放出光子，直接以熱的形式耗散掉（非輻射能量耗散）。3）將能量從一個葉綠素分子傳遞到鄰近的另一個葉綠素分子，能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后到達反應(yīng)中心，反應(yīng)中心葉綠素分子通過電荷分離將能量傳遞給電子受體，從而進行光化學(xué)反應(yīng)。以上這3個過程