醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實驗教案

1、 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課程實驗教案 實 驗 一實驗名稱：E-玫瑰花環(huán)形成實驗 計劃學(xué)時：4 學(xué)時實驗?zāi)康呐c要求：1.掌握人T淋巴細(xì)胞形成E-花環(huán)的實驗原理和操作方法。 2.熟悉T淋巴細(xì)胞的功能檢測方法。實驗儀器、試劑：淋巴細(xì)胞分層液（Ficou）、1%綿羊紅細(xì)胞、肝素抗凝人血、無鈣鎂Hanks液、水平離心機(jī)、0.8%戊二醛、37水浴箱、顯微鏡、其他。實驗對象：實驗同學(xué)實驗原理：體外測定人外周血中T淋巴細(xì)胞數(shù)量的方法有多種,以玫瑰花環(huán)試驗最為簡易常用，T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)有一定關(guān)系。人周圍血液中T淋巴細(xì)胞表面有綿羊紅細(xì)胞受體，與綿羊紅細(xì)胞相遇時，在其周圍形成花環(huán)樣細(xì)胞團(tuán)，凡能結(jié)合三

2、個以上綿羊紅細(xì)胞者稱為E攻瑰花環(huán)形成細(xì)胞。正常人的花環(huán)形成率為5070%，大致可以代表周圍血中T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。臨床上多用于某些疾病的診斷及療效的觀察。操作方法：1、取肝素抗凝血12ml，用分層液分出淋巴細(xì)胞并洗滌，用Hanks液調(diào)整細(xì)胞濃度為22.5106ml。2、取小試管加入l ml淋巴細(xì)胞懸液及1%羊紅細(xì)胞0.l ml，混勻置37水浴箱5分鐘。3、8001000 r/min低速離心5分鐘，放4冰箱2小時。4、輕輕旋轉(zhuǎn)試管使團(tuán)塊混勻，加2滴0.8%戊二醛液，搖勻，室溫靜置10分鐘，使E花環(huán)固定。5、取懸液一滴放于載玻片上，將稀釋的瑞氏染液加入玻片上染色3分鐘。6、棄去染液，待干后油鏡觀察，計

3、數(shù)200個淋巴細(xì)胞中形成花環(huán)的細(xì)胞效，算出百分率。實驗現(xiàn)象與數(shù)據(jù)：1、淋巴細(xì)胞染成深藍(lán)色，羊紅細(xì)胞染成淡紅色。2、每個淋巴細(xì)胞上粘附三個以上羊紅細(xì)胞者即為玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞。結(jié)果分析與結(jié)論：共計200個T淋巴細(xì)胞，算出形成花環(huán)細(xì)胞占全細(xì)胞數(shù)的百分率。正常人的花環(huán)形成率為5070%，大致可以代表周圍血中T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。臨床上多用于某些疾病的診斷及療效的觀察。注意事項：1.離心時注意使用8001000r/min低速離心。2.要輕輕旋轉(zhuǎn)試管使團(tuán)塊混勻，以防形成的花環(huán)散開。思考與創(chuàng)新：實 驗二實驗名稱：淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗 計劃學(xué)時：實驗?zāi)康呐c要求：1.掌握淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象的試驗方法和原理。 2.熟悉淋巴母

4、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法。實驗儀器、試劑：1、正常人淋巴細(xì)胞（用分層液分出）。2、培養(yǎng)液：0.5%水解乳蛋白Hanks氏液（含20%小牛血清和青霉素100單位/ml、鏈霉素100微克/ml）。用5.6%NaHCO3調(diào)整PH至7.27.4。3、植物血凝素(PHA)，姬姆薩染液。4、青霉素小瓶、吸管、載玻片、顯微鏡、離心機(jī)、恒溫箱等。實驗對象： 實驗同學(xué)實驗原理： T淋巴細(xì)胞受到特異性抗原或非特異性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可反映人體細(xì)胞免疫功能水平，常被作為細(xì)胞免疫功能指標(biāo)之一。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗可從周圍血中分離出淋巴細(xì)胞，也可采用全血試驗。操作方法：

5、1、制備細(xì)胞懸液：用培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞稀釋成2l06/ml，細(xì)胞懸液。2、分裝：向兩個小瓶中各加2ml，細(xì)胞懸液,一瓶加PHA 0.1ml(100單位)，另瓶不加作對照。3、37培養(yǎng)72小時。離心沉淀，用Hanks液洗兩次。4、用沉淀推成血片,加姬姆薩染液栗色,鏡下觀察計數(shù)200個以上淋巴細(xì)胞，算出轉(zhuǎn)化率。實驗現(xiàn)象與數(shù)據(jù)：1、成熱的淋巴細(xì)胞:與外周血中小淋巴細(xì)胞形態(tài)一致、直徑68微米，核染色質(zhì)網(wǎng)密、無核仁、胞漿略大于核貢輕度嗜堿性。2、過度型淋巴細(xì)胞:直徑10一20微米核質(zhì)密，但有明顯核仁。3、淋巴母細(xì)胞，細(xì)胞增大，形態(tài)不規(guī)則，直徑2030微米，核也增大，染色質(zhì)網(wǎng)纖細(xì)有核仁12個，胞漿擴(kuò)大，強(qiáng)嗜

6、堿性可見數(shù)個空泡及顆粒。4、網(wǎng)狀細(xì)胞樣母細(xì)胞：細(xì)胞增，形態(tài)不規(guī)則，核淡染有1一2個大小不規(guī)則的核仁，胞漿擴(kuò)大、含空泡，嗜堿性不強(qiáng)有透明感。用姬姆薩染色后，計算200個淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)（包括過渡型、母細(xì)胞和分裂相淋巴細(xì)胞），依轉(zhuǎn)比的百分率判定T淋巴細(xì)胞的功能。結(jié)果分析與結(jié)論：對照管轉(zhuǎn)化率1%左右，加PHA之管轉(zhuǎn)化主約為70%左右。T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低可反映人體細(xì)胞免疫功能水平，常被作為細(xì)胞免疫功能指標(biāo)之一。注意事項：思考與創(chuàng)新：實 驗 三實驗名稱：中性粒細(xì)胞吞噬功能測定 計劃學(xué)時：4學(xué)時實驗?zāi)康呐c要求：1、掌握中性粒細(xì)胞吞噬白色葡萄球菌實驗的操作過程2、掌握瑞氏染色的基本步驟及吞

7、噬百分率的計算實驗儀器、試劑：葡萄球菌培養(yǎng)液 抗凝劑 載玻片 瑞氏染液 水浴箱 離心機(jī) 注射器 止血帶 消毒藥水 實驗對象：實驗同學(xué)實驗原理：中性粒細(xì)胞具有非特異性的吞噬功能。操作方法：1.采血：取人靜脈血2毫升，放入含肝素的小試管中，混勻，防止凝血。2.菌液制備：取葡萄球菌液，加生理鹽水離心洗滌23次(2000r/min, 510min），去上清，留沉淀加入生理鹽水，用比濁法配制到適宜濃度（1107 個/ml）。3.混合溫?。簩⒅苽浜玫木?.5毫升加入到抗凝的人靜脈血中輕輕混勻，置于37水浴箱中水浴30分鐘（每10分鐘輕搖勻一次）。4.吸取混合懸液點在玻片上，制成血涂片，干燥后進(jìn)行瑞氏染色

8、，油鏡下觀察。實驗現(xiàn)象與數(shù)據(jù)：鏡下可見中性粒細(xì)胞細(xì)胞核呈藍(lán)色，被吞噬的葡萄球菌呈藍(lán)（紫）色，計數(shù)200個中性粒細(xì)胞，并計算吞噬陽性細(xì)胞的百分率。結(jié)果分析與結(jié)論：吞噬率吞噬細(xì)菌中性粒細(xì)胞/200個中性粒細(xì)胞 100%注意事項：1.菌液配備時注意無菌操作。 2.注意靜脈血和菌液應(yīng)按一定體積比混合，血菌=51思考與創(chuàng)新：實 驗 四 實驗名稱：凝集反應(yīng) 計劃學(xué)時：實驗?zāi)康呐c要求：1、掌握抗原抗體反應(yīng)的特異性。2、熟悉凝集反應(yīng)的原理、方法和分類。實驗儀器、試劑：1、妊娠診斷血清(抗HCG血清)。2、妊娠診斷抗原(吸附有HCG的免疫微球)。3、待檢尿、正常尿、生理鹽水、吸管、試管、玻片等。實驗原理：凝集反

9、應(yīng)是完整的細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)抗體在一定條件下出現(xiàn)凝集物的現(xiàn)象。參與反應(yīng)的抗原稱凝集原，抗體稱凝集素。凝集反應(yīng)包括直接凝集反應(yīng)、間接凝集反應(yīng)、間接凝集抑制反應(yīng)、反向間接凝集反應(yīng)、協(xié)同凝集試驗、抗球蛋白試驗等。本實驗介紹間接凝集抑制反應(yīng)。可溶性抗原與抗體結(jié)合后不出現(xiàn)凝集。如把可溶性抗原吸附在載體微球上，成為人工免疫微球，再與抗體結(jié)合即出現(xiàn)凝集，此稱間接凝集反應(yīng)。由于載體微球增大了可溶性抗原的反應(yīng)面積，微球上少量抗原存在就足以出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。這種反應(yīng)的敏感性比沉淀反應(yīng)高得多。如先使可溶性抗原與抗體充分結(jié)合，再加入有關(guān)的免疫微球。因抗體已被抗原結(jié)合，不再出現(xiàn)免疫微球的凝集現(xiàn)象。這一試驗

10、稱間接凝集抑制反應(yīng)。絨毛膜促性腺激素(HCG)為可溶性抗原，在妊娠尿中含量顯著增高。如尿中有此抗原存在與相應(yīng)抗體(抗一HCG)結(jié)合后，加入吸附HCG的免疫微球時，不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，呈均勻乳液，如尿中無HCG存在，沒有抗原與抗體結(jié)合，再加入相應(yīng)的免疫微球時，即出現(xiàn)肉眼可見的凝集(即凝集未被抑制)。操作方法：1、取一潔凈玻片，用蠟筆劃分1、2兩格。(圖1)待檢尿正常尿1、陽性結(jié)果2、陰性結(jié)果2、加被檢尿滴于1格內(nèi)，加正常尿滴于2格內(nèi)。3、每滴尿中各加抗HCG血清1滴搖勻或用牙簽混勻。4、再于各滴中加（HCG乳膠抗原。HCG兔疫微球）1滴；混勻，繼續(xù)搖動23分鐘，肉眼觀察結(jié)果。實驗現(xiàn)象與數(shù)據(jù)：妊娠尿滴

11、呈均勻乳狀，無凝集現(xiàn)象(陽性)。正常尿滴出現(xiàn)明顯凝集顆粒(陰性)。結(jié)果分析與數(shù)據(jù)：思考與創(chuàng)新：實驗八 實驗名稱：沉淀反應(yīng) 計劃學(xué)時：實驗?zāi)康呐c要求：1、掌握抗原抗體反應(yīng)的特異性和沉淀反應(yīng)的原理。2、熟悉雙向瓊脂擴(kuò)散、單向瓊脂擴(kuò)散的操作方法和結(jié)果分析。實驗儀器、試劑：（一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗： 1、抗體：甲胎蛋白診斷血清。2、抗原:肝癌病人甲胎蛋白陽性血清或正常人胚胎組織浸出液，待檢血清。3、1%生理鹽水瓊脂、載玻片、打孔器、毛細(xì)管等。（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗：1、3%生理鹽水瓊脂。2、抗體:免抗人毛I(xiàn)g抗體血清。3、抗原:待檢人血清、IgG參考抗原。4、塑料板、吸管、打孔器。實驗對象：實驗同學(xué)實驗

12、原理： （一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂對應(yīng)孔中各自向四周進(jìn)行擴(kuò)散，如抗原抗體相對應(yīng)，兩者在比例適當(dāng)處，就出現(xiàn)肉眼可見的白色沉淀線。若同時具有幾種抗原抗體系統(tǒng)，因各自的擴(kuò)散速度不同，可在瓊脂中出現(xiàn)多條沉淀線。（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗單擴(kuò)散實驗是一種定量試驗方法。先將一定量抗體混合于瓊脂中，傾注于平板上。凝固后打孔。加入待測抗原。如抗原與抗體一致時，抗原向孔四周擴(kuò)散，與孔周圍抗體形成抗原抗體復(fù)合物，呈白色沉淀環(huán)，沉淀環(huán)直徑大小與抗原濃度成正比。如先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出。本試驗主要用于檢查標(biāo)本中各種Ig與血清中各種補

13、體成分的測定。操作方法（一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗1、將1%生理鹽水瓊脂加熱溶化。2、制備瓊脂板:取潔凈載片一片，放一水平臺上，將溶化的25m1瓊脂趁熱用吸管注于玻片上，使其自然流成平面，瓊脂凝固后用打孔器打孔，去掉孔中的瓊脂。3、加樣:中央孔中加入甲胎蛋白（AFP）診斷血清，1、4孔加肝癌病人陽性血清，2、3、5、6孔加待檢血清。加血清至滿勿外溢。不可有氣泡。4、加樣后，將掠脂板放入有一定濕度帶蓋容器中，置37溫箱，24小時觀察結(jié)果。（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗1、制備含抗IgG抗體的瓊脂板:溶化的3%瓊脂、待冷至56時吸取1.5ml瓊脂與等量適當(dāng)稀釋的抗IgG抗體混合均勻。傾注于水平放置的塑料板上，制

14、成厚薄均勻的瓊脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每排5孔、孔距810mm，孔要圓整光滑。 圖示 單向瓊脂擴(kuò)散試驗?zāi)Ｊ?、加樣:用微量加樣器加樣。(1) 第一排五孔分別加入不同濃度(20、25、50、100、200倍)的參考IgG抗原10l。(2)第二排五孔，同法加1:50待檢血清10l， 3將瓊脂板平放于保持一定濕度的帶蓋容器內(nèi)，37溫箱放置24小時觀察結(jié)果。實驗現(xiàn)象與數(shù)據(jù)：結(jié)果分析與結(jié)論：（一）雙向瓊脂擴(kuò)散試驗1、1、4孔為陽性對照孔(加已知陽性標(biāo)本)，與中央孔間出現(xiàn)乳白色沉淀線。2、其余各孔與中央孔如出現(xiàn)沉淀線，且一端與陽性對照沉淀線相吻合者為陽性。證明該份血清含有甲胎蛋白。如兩條沉淀線相交，

15、表明二者抗原性不同，出現(xiàn)的沉淀線另一種抗原抗體反應(yīng)，不能判定陽性。3、如待檢孔與中央抗體孔間未出現(xiàn)沉淀線為陽性，證明待檢血清中沒有甲胎蛋白。圖示雙向瓊脂擴(kuò)散試驗結(jié)果 2、6孔：吻合沉淀線（陽性）。5孔：交叉沉淀線（陰性）。3孔：無沉淀線（陰性）。（二）單向瓊脂擴(kuò)散試驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及血清標(biāo)本中IgG含量的測定。1、以各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原孔沉淀環(huán)直徑為橫座標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為縱座標(biāo)在半對數(shù)座標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、依待檢血清標(biāo)本孔沉淀直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，將查得的唾G含量乘以標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，即為血清中IgG的含量。注意事項：思考與創(chuàng)新：實 驗 九實驗名稱：巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗 計劃學(xué)時：實驗?zāi)?/p>

16、的與要求：1、掌握巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能。 2、熟悉巨噬細(xì)胞吞噬功能試驗的原理和操作方法。實驗儀器、試劑：1、1%雞紅細(xì)胞懸液、瑞氏染液。2、6%可溶性淀粉肉湯 肉湯培養(yǎng)液100ml加入可溶性淀粉6g，混勻后煮沸滅菌備用。3、解剖小器械一套、無菌注射器、顯微鏡。實驗動物：小白鼠實驗原理:巨噬細(xì)胞具有吞噬大顆粒異物的特性，通常選用雞紅細(xì)胞作為吞噬顆粒，將其注入小鼠腹腔中，腹腔中巨噬細(xì)胞則將雞紅細(xì)胞吞入。取小鼠腹腔液涂片、染色后可見雞紅細(xì)胞被吞噬的現(xiàn)象，計數(shù)100個吞噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)可判斷其吞噬功能。操作方法：1、于驗前3天，小白鼠腹腔內(nèi)注射6%可溶性淀粉肉湯1ml。2、試驗當(dāng)天于每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5ml 1%雞紅細(xì)胞懸液，并輕揉腹部。3、注射后30min，將小鼠處死、取腹腔