儀器分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1、 熏肉制品中亞硝酸鹽含量的測(cè)定 【摘要】以-萘胺為顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，探究實(shí)驗(yàn)的最佳條件（最大波長(zhǎng)的測(cè)定，顯色劑用量的選擇以及顯色時(shí)間的選取），繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，測(cè)定熏肉制品中亞硝酸鹽的含量?！娟P(guān)鍵詞】肉制品，亞硝酸鹽，紫外-可見(jiàn)分光光度法【引言】（一）熏肉制品與亞硝酸鹽簡(jiǎn)介肉制品是一類(lèi)深受人民群眾喜愛(ài)的食品，在其生產(chǎn)過(guò)程中多采用亞硝酸鹽作為發(fā)色劑，它不僅能使肉制品保持良好的色澤，還能抑制肉毒梭狀芽孢桿菌，保證肉制品的后熟風(fēng)味。但近年來(lái)由于亞硝酸鹽攝入量過(guò)多引起的食物時(shí)中毒時(shí)有發(fā)生，且加硝處理過(guò)的肉制品中的亞硝酸鹽可與胺類(lèi)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的危害。1 亞硝

2、酸鹽的性質(zhì)亞硝酸和硝酸的鈉鹽和鉀鹽常被加入用于腌肉的混合物中，用來(lái)產(chǎn)生和保持色澤、抑制微生物和產(chǎn)生特殊的風(fēng)味。此外，亞硝酸鹽（150-200mg/kg）可抑制罐裝碎肉和腌肉中的梭狀芽孢桿菌。亞硝酸鹽的抗微生物作用為它使用于可能生成長(zhǎng)肉毒梭狀芽孢桿菌的腌肉中提供了正當(dāng)?shù)睦碛?。亞硝酸鹽含量只要控制在安全范圍內(nèi)使用不會(huì)對(duì)人體造成危害。肉制品中，亞硝酸鹽含量不得超過(guò)30mg/kg，這是因?yàn)閬喯跛猁}的中毒劑量是200毫克以上，而正常膳食中的亞硝酸鹽即使是大量用亞硝酸鹽做食品添加劑的肉類(lèi)，也不會(huì)超過(guò)50毫克。2 發(fā)色原理亞硝酸鹽在肉中形成一氧化一氮，而一氧化一氮與血紅素類(lèi)化合物作用生成亞硝酰肌紅蛋白，這種

3、色素產(chǎn)生了腌肉的紅色。3 中毒后癥狀亞硝酸鹽是不會(huì)蓄積在體內(nèi)的，膳食中絕大部分亞硝酸鹽隨尿排出，不會(huì)對(duì)人體造成危害。過(guò)量亞硝酸鹽進(jìn)入人體，會(huì)氧化血液中的血紅蛋白為高鐵血紅蛋白，后者無(wú)攜氧功能，導(dǎo)致組織缺氧，引起腸原性青紫癥，皮膚青紫是本病的特征，尤以口唇青紫最為普遍。口服亞硝酸鹽10分鐘至3小時(shí)后，可出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等癥狀。嚴(yán)重者出現(xiàn)意識(shí)喪失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。4 亞硝酸鹽中毒作用機(jī)理當(dāng)血紅蛋白中的鐵處于+2（亞鐵）并且缺乏配體鍵合所需的第6部位時(shí)它被稱(chēng)為肌紅蛋白，是由珠蛋白和血紅素組成的絡(luò)合物，位居血紅蛋白中央的鐵原子(d2sp3)具有6個(gè)配位部位，其中4個(gè)分別被4吡咯環(huán)上的氮原

4、子占據(jù)，第5個(gè)配位部位與珠蛋白的組氨酸殘基鍵合，剩余的第6個(gè)配位部位可與各種配基提供的電負(fù)性原子絡(luò)合。亞硝酸鹽為強(qiáng)氧化劑，進(jìn)人人體后，可使血中低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，失去運(yùn)氧的功能，導(dǎo)致組織缺氧。（二）亞硝酸鹽的測(cè)定方法為了有效的控制其毒性，檢測(cè)其在食品中的殘留量，目前常采用的測(cè)定方法主要有光度法、色譜法、電化學(xué)法。其中光度法又分為鹽酸萘乙二胺法、格里試劑比色法、催化光度法、紫外光度法；色譜法中有離子色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法；電化學(xué)法又分為示波極譜法、伏安法。還有一些新的方法如化學(xué)發(fā)光法、熒光法、原子吸收光譜法等。1 光度法1.1鹽酸萘乙二胺法 在弱酸性溶液中，NO2-與對(duì)氨

5、基苯磺酸反應(yīng)生成重氮化合物后，再與鹽酸萘乙二胺偶聯(lián)生成紫紅色的偶氮染料，用分光光度法在540nm處測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較定量。1.2格里試劑比色法 GB50090332003測(cè)定方法中，其中一種方法就是格里試劑比色法，其原理是在弱堿性條件下，用熱水從樣品中提取NO2-，然后用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白，過(guò)濾后，在弱酸條件下，NO2-與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化后，再和N1萘基乙二胺耦合形成紅色偶氮染料，最大吸收波長(zhǎng)為538nm，所選擇的顯色劑不一樣，最大吸收波長(zhǎng)也有所不同。針對(duì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定和工藝的不同，以及檢測(cè)過(guò)程中pH、溫度、放置時(shí)間對(duì)顯色的影響，在檢測(cè)肉制品中NO2-時(shí)，格里試劑比色法的準(zhǔn)確性

6、和穩(wěn)定性均高于鹽酸萘乙二胺法。另外用對(duì)氨基苯磺酰胺代替對(duì)氨基苯磺酸，其靈敏度、精密度均得到提高。1.3催化分光光度法 主要原理是在一定的溫度和酸性條件下，NO2-對(duì)KBO3氧化染料(或指示劑)而褪色的反應(yīng)具有較明顯的催化作用，且在一定NO2-的濃度范圍內(nèi)，吸光度變化與NO2-濃度成較好的線(xiàn)性關(guān)系，因此，可用該原理定量溶液中NO2-的濃度。1.4紫外分光光度法 在稀鹽酸介質(zhì)中，NO2-與堿性品紅發(fā)生重氮反應(yīng)，用8羥基喹啉作偶聯(lián)劑，在弱堿性條件下，生成茶紅色偶氮染料來(lái)定量測(cè)定NO2-含量。光度法是測(cè)定NO2-的經(jīng)典方法，其檢測(cè)所需費(fèi)用較低，靈敏度較高，不經(jīng)分離可直接同時(shí)測(cè)定樣品中NO3-和NO2-

7、，具有較好的選擇性，操作簡(jiǎn)便?！? 色譜法2.1離子色譜法 主要原理是當(dāng)淋洗液攜帶樣品進(jìn)入分離柱后，樣品離子便與離子交換功能基的平衡離子爭(zhēng)奪樹(shù)脂的離子交換位置。經(jīng)過(guò)多次競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到交換平衡。由于不同離子對(duì)樹(shù)脂固定相的親和力不同，通過(guò)淋洗液的不斷淋洗，各種離子便先后從色譜柱上被洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)了分離。通過(guò)檢測(cè)器，即可經(jīng)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子，得到一個(gè)個(gè)色譜峰，然后與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，根據(jù)保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積或峰高定量。用紫外檢測(cè)離子色譜法對(duì)醬腌菜中的NO3-與NO2-進(jìn)行定量分析。樣品經(jīng)過(guò)超聲提取后，以1.8mmol/LNaCO3及1.7mmol/LNaHCO3為淋洗液，經(jīng)DIONEXIonpacAS4A

8、SC分析柱分離，于210nm處紫外檢測(cè)。該法可以采用其他類(lèi)型的色譜柱進(jìn)行分離，所用的檢測(cè)器也可選用化學(xué)抑制型電導(dǎo)檢測(cè)器(可大幅度降低淋洗液的電導(dǎo)值)。離子色譜法所用的化學(xué)試劑較少，并且實(shí)驗(yàn)耗時(shí)相對(duì)來(lái)說(shuō)較少。2.2高效液相色譜法 食品中NO2-含量的重氮化耦合高效液相色譜法測(cè)定方法是將食品樣品中蛋白質(zhì)、脂肪除去后，NO2-與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與N一1一萘乙二胺耦合之后，進(jìn)行HPLC分析。若采用反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測(cè)器法測(cè)定鹵肉制品中NO3-及NO2-的含量，則該方法選擇四丁基溴化銨作為離子對(duì)試劑，與NO3-和NO2-陰離子形成中性締合物，在甲醇一混合磷酸鹽流動(dòng)相中，被非極性鍵合相

9、柱(ODS)分離并定量檢測(cè)。該方法靈敏度高，并且樣品中其他成分如色素、動(dòng)物性蛋白等對(duì)檢測(cè)不構(gòu)成干擾。3 電化學(xué)法3.1示波極譜法 GB50090332003測(cè)定方法中，另外一種方法是示波極譜法，試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性的條件下，NO2-與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，在弱堿性條件下再與8羥基喹啉耦合形成橙色染料，該染料在汞電極上還原產(chǎn)生電流，電流與NO2-的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，可與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較定量。3.2伏安法伏安法 是在酸性介質(zhì)中以玻碳電極(GCE)為工作電極的鐵氰化鉀電催化還原亞硝酸鹽的電化學(xué)行為及電分析方法。當(dāng)K3Fe(CN)6濃度一定時(shí)，電催化還原峰電流與NO2-濃度在4.010-7

10、1.010-4mol/L范圍時(shí)有良好的線(xiàn)性關(guān)系，運(yùn)用方波伏安法在優(yōu)化條件下測(cè)定了水樣中亞硝酸鹽含量，測(cè)定結(jié)果令人滿(mǎn)意。相比較可以發(fā)現(xiàn)，光度法所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)廉、靈敏度較高，具有實(shí)用性和可操作性。由于NO2-在固體電極(如GCE，Au和Pt等)上氧化(或還原)一般需要較高的過(guò)電位，因而不易直接發(fā)生電化學(xué)氧化(或還原)反應(yīng)，故電化學(xué)方法的使用范圍不如光度法使用范圍廣。而熒光法、化學(xué)發(fā)光法、原子吸收光譜法等對(duì)儀器的要求較高。分光光度法以其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作快捷、靈敏度高、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)，深受歡迎。本實(shí)驗(yàn)研究了以-萘胺為顯色劑，利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定肉制品中的亞硝酸鹽的含量的方法。結(jié)果證明，此方法

11、簡(jiǎn)單、快捷、準(zhǔn)確，是一種食品檢測(cè)的好方法。現(xiàn)實(shí)生活中，食品檢測(cè)人員經(jīng)常采用亞硝酸鹽快速測(cè)試盒測(cè)定食品中亞硝酸鹽的含量，亞硝酸鹽快速測(cè)試盒采用N-1-萘乙二胺代替?zhèn)鹘y(tǒng)的a-萘胺，使顯色的靈敏度高，顯色的摩爾質(zhì)量增大，測(cè)定出來(lái)的結(jié)果更準(zhǔn)確，但鑒于各方面的局限性，本實(shí)驗(yàn)我們采用紫外分光光度法，以a-萘胺為顯色劑測(cè)定熏肉制品中亞硝酸鹽的含量。【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私庋庵衼喯跛猁}的作用和危害，以及含量測(cè)定的方法；掌握紫外分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽含量的基本原理與操作方法；明確亞硝酸鹽的測(cè)定與控制成品質(zhì)量的關(guān)系?！緦?shí)驗(yàn)原理】本次試驗(yàn)選定紫外分光光度法來(lái)測(cè)定熏肉中亞硝酸鹽的含量：以-萘胺為顯色劑，利用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)

12、定肉制品中的亞硝酸鹽的含量，其實(shí)驗(yàn)原理如下：樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，抽提分離出亞硝酸鹽，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)生成重氮鹽，此重氮鹽再與-萘胺試劑發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紫紅色偶氮化合物，其最大吸收波長(zhǎng)為547nm，其顏色的深度與樣液中亞硝酸含量成正比，可測(cè)定吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較定量。反應(yīng)式如下：肉制品中亞硝酸鹽含量=（mg/kg）式中：X為由測(cè)得的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上對(duì)應(yīng)的亞硝酸鈉質(zhì)量濃度（g/mL）；m為樣品質(zhì)量（g）。經(jīng)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)參考，試劑空白和去離子水對(duì)吸光度的影響相差不大，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)的參比溶液的選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)方便原則，選擇去離子水為參比溶液。此外，分別在

13、15%、20%與25%的鹽酸中的測(cè)定結(jié)果顯示，酸度變化對(duì)顯色反應(yīng)的影響并不是很明顯，實(shí)驗(yàn)中用20%的鹽酸溶解對(duì)氨基苯磺酸測(cè)得的吸光度相對(duì)較大，因此實(shí)驗(yàn)選取20%的鹽酸溶解對(duì)氨基苯磺酸?！緝x器與試劑】試劑：（1） 亞鐵氰化鉀溶液：稱(chēng)取10.619克亞鐵氰化鉀K4Fe(CN)63H2O溶于水，并稀釋至100mL。（2） 乙酸鋅溶液：稱(chēng)取22.0克乙酸鋅Zn(CH3COO)22H2O，加3mL冰醋酸溶于水，并稀釋至100mL。（3） 飽和硼砂溶液：5.0克硼酸鈉（Na2BO410H2O）溶于100mL熱水中，冷卻備用。（4）0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液（4g/L）：稱(chēng)取0.4g對(duì)氨基苯磺酸，溶于100m

14、L20%鹽酸中，臵棕色瓶中，混勻，避光保存。0.2%-萘胺溶液(2g/L)：稱(chēng)取0.1g鹽酸萘乙二胺，以水定容50.00mL，避光保存。（5） 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200.0g/mL）：精確稱(chēng)取0.1000g于硅膠干燥器中干燥24h的亞硝酸鈉（優(yōu)級(jí)純），加水定容到500.00mL。（6） 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（5g/mL）：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2.50mL，臵于100mL的容量瓶中，加水稀釋到刻度。儀器：砧板，菜刀 UV8500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 比色皿2個(gè) 分析天平1mL、2mL、5mL、10mL、20mL移液管各1支50mL燒杯1個(gè)，100mL燒杯1個(gè)，500mL燒杯1個(gè)10mL量筒1

15、個(gè)，100mL量筒1個(gè)50mL容量瓶12個(gè)，100mL容量瓶4個(gè)，200mL容量瓶1個(gè)，500mL容量瓶2個(gè)濾紙、漏斗、玻璃棒過(guò)濾裝置一套【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟】1、樣品處理樣品中硝酸鹽及亞硝酸鹽的提?。悍Q(chēng)取經(jīng)剁碎混合均勻的樣品5.0565g于100mL燒杯中，加入硼砂飽和溶液12.5mL，以玻璃棒攪拌，然后用70左右的水約300mL，將其稀釋轉(zhuǎn)移到500mL容量瓶，沸水浴中加熱15分鐘，取出，邊轉(zhuǎn)動(dòng)邊加入5mL亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加5mL乙酸鋅溶液以沉淀蛋白質(zhì)。冷卻到室溫，用水定容，搖勻。放置片刻，去除上層脂肪并過(guò)濾，棄去前30mL濾液。2、最大波長(zhǎng)的測(cè)定于內(nèi)層1cm比色皿中，用空白溶液即參比

16、溶液進(jìn)行基線(xiàn)調(diào)零。調(diào)零后，把靠近外面的比色皿拿出換裝濃度為0.2040g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液在610nm450nm之間進(jìn)行掃描，得到最大吸收波長(zhǎng)max=_545.7_nm。3、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制用移液管精確吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液(5g/mL)0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0mL于一組50mL容量瓶中，各加水至約25mL，分別加2mL0.4g/mL對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻，靜置35min后，各加入2mL0.2%-萘胺溶液，并用水定容到50mL，搖勻。（濃度分別為0.00、0.0204、0.0408、0.0612、0.0816、0.1020、0.1530和0.2040ug/

17、mL）靜置15min后，用1cm比色皿，用分光光度計(jì)在最大波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白。以測(cè)得的各比色液的吸光度對(duì)應(yīng)的亞硝酸濃度作曲線(xiàn)。4、亞硝酸鹽含量的測(cè)定取20mL待測(cè)液于25mL容量瓶中，加1mL0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，搖勻。靜置35分鐘后，加入0.5mL0.2%-萘胺溶液，定容，搖勻。比色測(cè)定，記錄吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程算得相應(yīng)的亞硝酸鈉濃度（g/mL），計(jì)算試樣中亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計(jì)）的含量?！緦?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果分析】1. 最大吸收波長(zhǎng)的確定結(jié)果分析：由上圖可知，待測(cè)物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)為545.7nm，故此實(shí)驗(yàn)選用波長(zhǎng)545.7nm為測(cè)定波長(zhǎng)。2、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（max=_5

18、45.7_nm, 顯示時(shí)間為15min）V(NaNO2)/ml0.00.20.40.60.81.01.52.0C(NaNO2) (g/mL）0.000.02040.04080.06120.08160.10200.15300.2040吸光度A0.0070.0270.0340.0470.0620.0800.1190.151結(jié)果分析：繪制出亞硝酸鈉溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如上圖，可根據(jù)其線(xiàn)性方程求出待測(cè)液的亞硝酸濃度，曲線(xiàn)的相關(guān)系數(shù)R2=0.99610，線(xiàn)性關(guān)系較好，由圖可知，第2個(gè)點(diǎn)偏離較大。出現(xiàn)誤差的原因：定容時(shí)操作不準(zhǔn)確，即配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)出現(xiàn)了誤差。3.待測(cè)液中亞硝酸含量的測(cè)定待測(cè)溶液吸光度A0.053 待測(cè)液中亞硝酸含量(g/ml）0.065結(jié)果分析：由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程y=0.7089x+0.0071，可求的待測(cè)溶液的濃度x=（0.053-0.0071）/0.7089=0.0647g/ml，由計(jì)算公式：肉制品中亞硝酸鹽含量= （