-免疫比濁檢驗(yàn)技術(shù)原理與進(jìn)展

1、免疫比濁分析技術(shù)原理與進(jìn)展,桂林英美特生物技術(shù)研究所,一、免疫學(xué)基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比濁技術(shù)原理,免疫比濁檢驗(yàn)技術(shù)原理與進(jìn)展,一、免疫學(xué)基本原理,1、抗原與抗體 2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng) 3、免疫學(xué)反應(yīng)的檢測(cè)技術(shù),1、抗原與抗體,抗原（Antigen, Ag）是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)。 “應(yīng)” 是指抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物-抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞 “答” 是指相應(yīng)抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合并將其排除體外） 抗原的免疫原性和免疫反應(yīng)性 完全抗原與半抗原 抗原表位與抗原結(jié)合價(jià)位,1、抗原與抗體,1、抗原與抗體,免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指抗原分子能夠刺激機(jī)

2、體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。,Ag,抗體,免疫原性示意圖,1、抗原與抗體,免疫反應(yīng)性：是指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。,抗原性（免疫反應(yīng)性）示意圖,抗體,1、抗原與抗體,完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)。 半抗原（hapten，又稱不完全抗原 incomplete antigen ）無(wú)免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。 載體（carrier）賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)。 半抗原 + 蛋白質(zhì)（載體） 完全抗原。,半抗原,+,載體,抗體,完全抗原,半抗原載體效應(yīng)示意圖 半抗原 + 蛋白質(zhì)（載體） 完

3、全抗原,1、抗原與抗體,抗原決定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗體Fab片段特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 構(gòu)象決定簇 ：構(gòu)象決定簇（conformational determinant）由空間構(gòu)象形成的決定簇，序列上不連續(xù)。 順序決定簇：順序決定簇（sequence determinant），又稱線性決定簇（linear determinant），序列相連續(xù)的氨基酸肽片段構(gòu)成的決定簇。 抗原結(jié)合價(jià)：抗原結(jié)合價(jià)（antigenic valence）是指能夠與抗體分子結(jié)合的決定簇?cái)?shù)目。,1、抗原與抗體,1、抗原與抗體,抗原表位的性質(zhì)、數(shù)目、位置、空間排列和立體構(gòu)象決

4、定著抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性。,1、抗原與抗體,共同表位（common epitope）指不同抗原之間含有的相同或相似的抗原表位。 交叉反應(yīng)（cross-reaction）指抗體或致敏淋巴細(xì)胞對(duì)具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反應(yīng)（交叉結(jié)合）。,1、抗原與抗體,抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的球蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結(jié)構(gòu)性概念 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。 抗體一定是球蛋

5、白，球蛋白未必是抗體,1、抗原與抗體,抗體的分子結(jié)構(gòu),1、抗原與抗體,“Y”型，四肽鏈 重鏈 （5種: 、 、） 輕鏈 （2種: 、） 可變區(qū) （V區(qū)） 超變區(qū)（ 又稱CDR 互補(bǔ)決定區(qū)） 骨架區(qū): FR 恒定區(qū) （C區(qū)） 鉸鏈區(qū),1、抗原與抗體,根據(jù)重鏈抗原性的不同，免疫球蛋白可以分為5類： IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon),1、抗原與抗體,根據(jù)輕鏈C區(qū)抗原性不同，免疫球蛋白可分為2型) (kappa)型 (lambda)型 輕鏈存在于各類免疫球蛋白中 同一個(gè)免疫球蛋白分子中的輕鏈同型,1、抗原與抗體,抗體的

6、生物學(xué)功能特異性結(jié)合抗原 超變區(qū)表位 靜電力、氫鍵、范德華力 可逆 影響因素：PH、溫度、電解質(zhì),結(jié)合基礎(chǔ),2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng),抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定的。 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段。第一為抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，此階段反應(yīng)快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。第二為可見(jiàn)反應(yīng)階段，抗原抗體復(fù)合物在環(huán)境因素（如電解質(zhì)、pH、溫度、補(bǔ)體）的影響下，進(jìn)一步交聯(lián)和聚集，表現(xiàn)為凝集、沉淀、溶解、補(bǔ)體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)。 抗原抗體的結(jié)合使電荷減少或消失，蛋白質(zhì)由親水膠體

7、轉(zhuǎn)化為疏水膠體。 四種分子間引力（電荷引力、范登華引力 、氫鍵結(jié)合力 和疏水作用 ）參與并促進(jìn)抗原抗體間的特異性結(jié)合。,2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng),典型的抗原抗體結(jié)合反應(yīng),特異性識(shí)別,形成抗原抗體復(fù)合物,2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng),抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn),特異性 按比例 可逆性,2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng),2、抗原抗體的結(jié)合免疫學(xué)反應(yīng),影響抗原抗體反應(yīng)的因素 電解質(zhì)（離子強(qiáng)度）：抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，雖由親水膠體變?yōu)槭杷z體，若溶液中無(wú)電解質(zhì)參加，仍不出現(xiàn)可見(jiàn)反應(yīng)。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1

8、，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢(shì)下降。當(dāng)電勢(shì)降至臨界電勢(shì)（1215mV）以下時(shí)，則能促使抗原抗體復(fù)合物從溶液中析出，形成可見(jiàn)的沉淀物或凝集物。 酸堿度（pH）：抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進(jìn)行。蛋白質(zhì)具有兩性電離性質(zhì)，因此每種蛋白質(zhì)都有固定的等電點(diǎn)?？乖贵w反應(yīng)一般在pH為68進(jìn)行。PH過(guò)高或過(guò)低都將影響抗原與抗體的理化性質(zhì)，例如pH達(dá)到或接近抗原的等電點(diǎn)時(shí)，即使無(wú)相應(yīng)抗體存在，也會(huì)引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽(yáng)性反應(yīng)。 溫度：在一定范圍內(nèi)，溫度升高可加速分子運(yùn)動(dòng)，抗原與抗體碰撞機(jī)會(huì)增多，使反應(yīng)加速。但若溫度高于56時(shí)，可導(dǎo)致已結(jié)合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；

9、在40時(shí)，結(jié)合速度慢，但結(jié)合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應(yīng)溫度為37。每種試驗(yàn)都有其獨(dú)特的最適反應(yīng)溫度，例如冷凝集素在4左右與紅細(xì)胞結(jié)合最好，20以上反而解離。 其它：適當(dāng)振蕩也可促進(jìn)抗原抗體分子的接觸，加速反應(yīng)。,3、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),凝集與沉淀 比濁 電位、微天平,放射性核素標(biāo)記 酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和膠體金標(biāo)記 化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記或偶聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng),非標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù),標(biāo)記免疫檢測(cè)技術(shù),二、免疫沉淀,凝集：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆?？乖?，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為凝集反應(yīng)（agglutination）是最經(jīng)典的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。,二、免疫沉淀,免疫沉淀反應(yīng):(prec

10、ipitation) 可溶性抗原與相應(yīng)抗體，在適宜條件下發(fā)生結(jié)合，出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。,免疫沉淀,液體內(nèi)沉淀反應(yīng),凝膠內(nèi)沉淀反應(yīng),免疫電泳技術(shù),免疫濁度技術(shù),絮狀沉淀試驗(yàn),環(huán)狀沉淀試驗(yàn),單向擴(kuò)散試驗(yàn),雙向擴(kuò)散試驗(yàn),試管法 平板法,免疫電泳 對(duì)流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫固定電泳,透射免疫比濁t(yī)urbidimetermeasure 散射免疫比濁nephelomitermeasure,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀釋,加入抗血清,各管抗體量不變,振搖 混勻、37孵育,沉淀量不同,試管內(nèi)絮狀沉淀試驗(yàn),輕搖,絮,狀,沉,示,意,圖,淀,Ag,Ab Ag,

11、Ab,Ag,凝膠內(nèi)沉淀試管法,單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn),凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)平板法,標(biāo)準(zhǔn)品抗原濃度測(cè)定,不同病人抗原濃度測(cè)定,原理,將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測(cè)抗原在凝膠中自由擴(kuò)散，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。,凝膠內(nèi)沉淀雙向瓊脂擴(kuò)散原理示意圖,Ab,Ag,模擬圖,染色瓊脂圖,1.抗原抗體雙向自由擴(kuò)散 2.24小時(shí)出結(jié)果 3.呈現(xiàn)沉淀線或弧,三、免疫比濁技術(shù)原理,當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢測(cè)抗原含量。,檢測(cè)器,光源 透鏡 濾光片,平光線,

12、散,射,透射光,光波,比濁測(cè)定法原理示意圖,d,當(dāng)復(fù)合物大于入射光波的1/20時(shí)，形成不對(duì)稱前向散射， 在90o以前的角度測(cè)量散射光皆取得最佳效果，散射光 的量代表復(fù)合物的量,當(dāng)復(fù)合物小于入射波長(zhǎng)時(shí)呈全透射， 透射與散射相當(dāng),三、免疫比濁技術(shù)原理,免疫比濁技術(shù)分類：,按光路,透射免疫比濁 散射免疫比濁,按測(cè)定時(shí)間,終點(diǎn)比濁 速率比濁,按增敏劑,無(wú)增敏 PEG增敏 膠乳增敏,透射比濁法和散射比濁法光路,檢測(cè)器A,檢測(cè)器B,IC,I0,I,I,透射比濁法,散射比濁法,透射免疫比濁法是在180角， 即在直射角度上測(cè)定光透射強(qiáng)度。,散射比濁法在光路的596角的方向上測(cè)量散射光強(qiáng)度。,單色器,透 射 比

13、 濁 計(jì),散射 比濁計(jì),散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖,透射光 散射光,散射光,透射免疫比濁法（transmission turbidimetry,原理,抗原與抗體在一定緩沖液中形成IC，當(dāng)光線透過(guò)反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)IC粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光減少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。,透射免疫比濁法,溶液中形成的復(fù)合物分子應(yīng)足夠大(35-100nm) 溶液中形成的復(fù)合物分子要足夠多 控制抗原抗體反應(yīng)的溫度和時(shí)間 加增敏劑，提高復(fù)合物形成速度，縮短檢測(cè)時(shí)間 應(yīng)選擇親和力好、效價(jià)高的抗體，保證抗體過(guò)量 將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至少5個(gè)濃度測(cè)定，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙

14、上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,反應(yīng)要求,透射免疫比濁法,靈敏度較低。要求抗原抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大、足夠多，分子太小則入射光直接通過(guò)。加增敏劑。 直線光路，靈敏度有先天缺陷。設(shè)計(jì)散射比濁。 透射比濁是依據(jù)透射光減弱的原理來(lái)定量的，因此只能測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的第二階段，檢測(cè)仍需抗原抗體溫育反應(yīng)時(shí)間，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。,缺陷,散射免疫比濁法,抗原抗體復(fù)合物對(duì)一定波長(zhǎng)的光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強(qiáng)度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān),原理,單色器,散射 比濁計(jì),散射光,散射免疫比濁法,定時(shí)散射比濁分析,基本原理： 免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù)，反應(yīng)分兩個(gè)階段，預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段,保證抗原不過(guò)量的方法： 確保反

15、應(yīng)體系抗體過(guò)量 對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定,時(shí)間 檢測(cè)分兩個(gè),在預(yù)反應(yīng)時(shí)段， 加小量樣本與 抗原/抗體反應(yīng)， 測(cè)定第一次散 射光信號(hào)值,加全量樣本，約反應(yīng) 2分鐘后，第二次測(cè)定散射光信號(hào),信號(hào)峰值 計(jì)算機(jī)處理 轉(zhuǎn)換為樣 品濃度,預(yù)反應(yīng)階段 5ul樣本,抗原過(guò)剩區(qū),閾值,信號(hào),反 應(yīng) 階 段 45ul樣本,7.5秒,2分鐘,定時(shí)散射比濁反應(yīng)曲線圖,抗原不過(guò)量 抗原過(guò)量,散射免疫比濁法,速率散射比濁分析,基本原理： 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定法，適時(shí)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號(hào)。是測(cè)定抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。 所謂速率，是在單位時(shí)間內(nèi)抗原抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速度。將各單位時(shí)間內(nèi)形成復(fù)合物

16、的速率及測(cè)定的散射信號(hào)連接在一起，即是動(dòng)態(tài)的速率比濁分析。 當(dāng)儀器測(cè)定到某一時(shí)間內(nèi)形成速率下降時(shí)，即出現(xiàn)速率峰，該峰值的高低，即代表所測(cè)抗原的量。 速率峰值一般在25秒時(shí)出現(xiàn)。 在反應(yīng)介質(zhì)中加入一定量的促凝劑，可加速抗原抗體復(fù)合物的形成，以減少反應(yīng)時(shí)間。 速率法的優(yōu)點(diǎn)：是快速、不需要減去樣本和試劑本底讀數(shù)，校正結(jié)果也較穩(wěn)定。,抗原濃度遞增,散射光峰值,峰值信號(hào)與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖,A,B,C,D,F,G,H,I,反應(yīng)時(shí)間（秒）,0,60,85,散射率,抗體過(guò)量,抗原過(guò)量,第二峰值信號(hào),粒子增強(qiáng)免疫比濁分析技術(shù),基本原理 選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯(lián)抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原

17、時(shí)，則發(fā)生聚集，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過(guò)。當(dāng)兩個(gè)膠乳顆粒凝聚時(shí)，則使透射光減少，這種減少的程度與膠乳凝集成正比，當(dāng)然也與抗原量成正比。,特點(diǎn)：變非均相反應(yīng)為均相反應(yīng)，靈敏度提高（ 0.1ng/mL ）； 聚乙烯、聚苯乙烯等高分子膠乳顆粒，直徑100200nM; 以物理吸附（多抗）或化學(xué)交聯(lián)（單抗）方式與抗體連接； 基于單抗膠乳免疫散射速率比濁技術(shù)的定量分析是發(fā)展方向。,光波,d,d 2d,當(dāng)粒子直徑小于入射波長(zhǎng)時(shí)呈全透射， 透射與散射相當(dāng),當(dāng)粒子直徑大于入射光波的1/20時(shí)，形成不對(duì)稱前向散射， 在90o以前的角度測(cè)量散射光皆取得最佳效果，散射光的量 代表復(fù)合物的量,特定蛋白分

18、析儀簡(jiǎn)介,以免疫比濁法原理設(shè)計(jì)的特定蛋白分析儀有1970年 Immuno Preciptin）、1977年BEHRING公司開(kāi)發(fā)的BL（(Behring Laser Nephelometer)）、而后該公司又先后于1985年研制出BN（Behring Nephelometer Analysers）、1987年研制出TTS（Turbi Time System）和1988年開(kāi)發(fā)出BN-100 （Behring Nephelometer 100），美國(guó)BECKMAN 公司也在80年代推出ARRAY360和ARRAY360E兩種型號(hào)的特定蛋白分析儀，德國(guó)寶靈曼公司也同時(shí)推出 KeySys 特定蛋白分析儀，最近20