實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)與其應(yīng)用微生物131 沈濤 2摘 要：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、疾病研究、病毒檢測(cè)和食品安全檢測(cè)等方面，是分子生物學(xué)研究中的重要工具。本文對(duì)RT-qPCR技術(shù)的原理、檢測(cè)流程及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述。關(guān)鍵詞： RT-qPCR 原理 應(yīng)用 1 背 景

2、RT-qPCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為分子生物學(xué)研究中的重要工具，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，克服了終點(diǎn)法定量PCR產(chǎn)物的不足，使準(zhǔn)確定量RNA成為現(xiàn)實(shí)。然而受制于相關(guān)儀器、熒光染料和技術(shù)的發(fā)展。其應(yīng)用一直都沒(méi)廣泛展開(kāi)，近年來(lái)，隨著儀器和試劑的快速發(fā)展，RT-qPCR技術(shù)才得以發(fā)展起來(lái)。2 原 理： RT-qPCR的原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)。熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理是當(dāng)一個(gè)熒光分子(供體

3、分子)的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(受體分子)的激發(fā)光譜重疊時(shí)，供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減，受體熒光分子的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。ct值是RT-qPCR中一個(gè)很關(guān)鍵的因素，C代表循環(huán)，t代表閾值。每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，根據(jù)熒光探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行“實(shí)時(shí)”檢測(cè)并獲得未知樣品的ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。與普通PCR相比，RT-qPCR可以利用熒光信號(hào)實(shí)時(shí)

4、監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，可以對(duì)初始模板量進(jìn)行定量分析。3 流 程 一個(gè)典型的RT-qPCR試驗(yàn)流程包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、RNA提取、引物和探針設(shè)計(jì)、RTPCR、數(shù)據(jù)分析、對(duì)照組、重復(fù)數(shù)等。3.1 RT-qPCR試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于mRNA的超敏感性，反應(yīng)需要在嚴(yán)格的調(diào)控下進(jìn)行，適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)設(shè)計(jì)是研究基因表達(dá)成功的關(guān)鍵。試驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容包括樣品抽提方法、保存方法、解凍和均質(zhì)化過(guò)程、對(duì)照組設(shè)置、靶基因和內(nèi)參基因選擇，生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)次數(shù)等都要進(jìn)行嚴(yán)格的考慮，從而可以減少試驗(yàn)結(jié)果的可變性，保證其順利進(jìn)行。3.2 引物和探針設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)是PCR步驟中十分關(guān)鍵的一步，引物的好壞決定著試驗(yàn)的成功與否。

5、對(duì)于RT-qPCR，引物設(shè)計(jì)和目標(biāo)序列選擇的要求更為嚴(yán)格了。依照MIQE指南，熒光定量PCR的引物必須是以2 個(gè)外顯子設(shè)計(jì)引物，避免基因組DNA的擴(kuò)增，設(shè)計(jì)好的引物還要通過(guò)NCBI中的Primer-Blast來(lái)進(jìn)行比對(duì)，以確保目的基因的特異性7。3.3 RT-qPCR擴(kuò)增與驗(yàn)證 RT-qPCR擴(kuò)增流程中，PCR的效率、線性動(dòng)態(tài)范圍、退火溫度、融解曲線等，都要經(jīng)過(guò)測(cè)定和校準(zhǔn)。引物的優(yōu)化、引物濃度、退火溫度都會(huì)影響到PCR的效率，進(jìn)而影響試驗(yàn)的質(zhì)量。目前，常用Ct法對(duì)樣品和內(nèi)參基因不同濃度進(jìn)行歸一化，從而可以控制由抽提率、反轉(zhuǎn)率和擴(kuò)增效率產(chǎn)生的差異8。但前提是目的基因和對(duì)照基因必須具有相似的擴(kuò)增效

6、率。3.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析方法因所選定量方法的差異而有所差異。目前常用的RT-qPCR方法分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量是使用系列稀釋已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，從而對(duì)未知濃度的樣品進(jìn)行拷貝數(shù)的測(cè)定；相對(duì)定量是通過(guò)分別測(cè)定目的基因和參比基因的量，通過(guò)計(jì)算目的基因相對(duì)于參比基因的量，從而進(jìn)行樣品間相對(duì)量的比較，內(nèi)參基因一般選擇一些在細(xì)胞內(nèi)或者各種狀態(tài)下表達(dá)相對(duì)恒定的基因，如-actin、18S rRNA、GAPDH等。3.5 內(nèi)參基因 在RT-qPCR試驗(yàn)中，內(nèi)參基因被用來(lái)作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)照，以校正作為模板的cDNA所存在的數(shù)量差異。一個(gè)好的內(nèi)參基因應(yīng)確保在不同的組織、不同的處理

7、條件下表達(dá)都無(wú)變化。往往在試驗(yàn)中，要選用多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行比較，而選擇好的內(nèi)參基因，才能確保得到令人信服的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.6 試驗(yàn)重復(fù)性與重現(xiàn)性 試驗(yàn)中有生物學(xué)差異和技術(shù)差異都可能會(huì)影響到試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。生物學(xué)差異是不同個(gè)體或組織樣品間基因表達(dá)的差異所致；技術(shù)差異是試驗(yàn)藥品、器材不同和操作不當(dāng)?shù)热藶橐蛩貙?dǎo)致。為了減少生物學(xué)和技術(shù)差異對(duì)試驗(yàn)帶來(lái)的影響，一般除了設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)樣本還要設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并且每個(gè)重復(fù)要設(shè)置至少2個(gè)技術(shù)重復(fù)，另外，再加上2個(gè)無(wú)模板（NTC）對(duì)照。4 應(yīng) 用4.1 基因工程研究領(lǐng)域 RT-qPCR的出現(xiàn)不僅加強(qiáng)了有關(guān)對(duì)基因的量的研究方法，而且也加強(qiáng)了對(duì)基因的質(zhì)所發(fā)生

8、變化的研究。它可以檢測(cè)基因突變和基因組的不穩(wěn)定性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳分析、基因表達(dá)研究、單核苷酸多態(tài)性及突變分析以及轉(zhuǎn)基因的研究。4.2 腫瘤的分子診斷 腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用RT-qPCR都可以檢測(cè)出來(lái)。目前用此方法進(jìn)行過(guò)端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病RE基因、腫瘤MDR1基因等，盡管腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制尚未完全闡明，但相關(guān)基因的遺傳學(xué)改變的積累是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因之一已得到普遍承認(rèn)。癌基因的突變和表達(dá)增加，在許多腫瘤早期就出現(xiàn)。RT-qPCR技術(shù)不僅能有效地檢測(cè)到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量。4.3 病原體的分子檢

9、測(cè)RT-qPCR已應(yīng)用于肝病、性病以及人類免疫缺陷病毒等各種病原體的臨床診斷，為實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確診斷提供了有效的檢測(cè)方法。目前，用此方法還進(jìn)行了對(duì)人類結(jié)核桿菌、免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、巨細(xì)胞病毒、SARS病毒等病原體的檢測(cè)。5 總 結(jié) 準(zhǔn)確、靈敏、快速和經(jīng)濟(jì)的RT-qPCR 技術(shù)己發(fā)展成為一項(xiàng)完全自動(dòng)化的核酸定量技術(shù)，大大降低了假陽(yáng)性率，工作效率高，結(jié)果重現(xiàn)性好，且不必使用對(duì)人體有害的染色劑RT-qPCR 應(yīng)用較多的是醫(yī)學(xué)方面較成熟主要是在病原體檢測(cè)方面。在動(dòng)物學(xué)等領(lǐng)域的研究中 該技術(shù)應(yīng)用還較少。隨著RT-qPCR技術(shù)與生物芯片技術(shù)、肽核酸技術(shù)微解剖技術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的整合，應(yīng)用前景將越來(lái)越廣闊。參考文獻(xiàn)：1、 張弛宇 徐順高 黃新祥 一種新穎簡(jiǎn)便的熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相對(duì)定量方法的建立 生物化學(xué)與生物進(jìn)展 2005 32（9）2、 劉小榮 張?bào)?王勇平 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的理論研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 中國(guó)組織工程與臨床康復(fù) 第14卷 第2期 2010.01. 083、陳 旭，齊鳳坤，康立功，李景富 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 第41卷 第8期 2010.084、劉 萌，董 亮 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理、流程以及應(yīng)用