CHO細胞大規(guī)培養(yǎng)

1、摘要 CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細胞。微載體細胞培養(yǎng)開始于19世紀60年代末期，最早使用離子交換凝膠（DEAE-Sephadex A50）作為載體，輕微攪動即可懸浮在培養(yǎng)基中。由于這種微載體帶有電荷，利于細胞貼附于載體上進行生長繁殖。載體處于懸浮狀態(tài)時，這樣既可大大增加細胞附著面積，又使細胞能與培養(yǎng)基充分接觸，進而有利于細胞的生長，因此能達到大量培養(yǎng)細胞的目的。后來根據(jù)細胞附著生長的特點，對微載體進行改良，使其電荷或其介質更利于細

2、胞附著和生長。培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達6000 cm2，從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。首先將CHO細胞在無血清培養(yǎng)基（SAF-CHO-G-004）中進行無血清馴化。其次將CHO細胞（成功用無血清馴化后的細胞）用0.25%胰酶消化制成細胞懸液后，沿導流管加入含明膠微載體和SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基的WhcltonBioster瓶罐中連續(xù)培養(yǎng)生成一定量的種子細胞。最后將種子細胞進行大規(guī)模培養(yǎng)。運用半連續(xù)式培養(yǎng)來操作：在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。最后在

3、細胞培養(yǎng)過程中進行細胞常數(shù)的檢查和培養(yǎng)基內污染物的檢測一些抗凋亡策略來增加細胞培養(yǎng)的效率。關鍵字CHO細胞;明膠微載體;無血清培養(yǎng);半連續(xù)式培養(yǎng)目錄摘要1關鍵字：CHO細胞 明膠微載體 無血清培養(yǎng) 半連續(xù)式培養(yǎng)1緒論31.2CHO細胞培養(yǎng)的特性32.2.1培養(yǎng)基的物理性質52.2.2無血清培養(yǎng)73.1.2蛋白質作基質的微載體93.1.3微載體培養(yǎng)原理與操作103.2.2微載體培養(yǎng)種子細胞133.2.3微載體培養(yǎng)的細胞傳代133.3半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作144.2細胞常數(shù)檢查164.3CHO細胞培養(yǎng)內污染物的檢測164.3.2真菌污染對細胞的影響及污

4、染物的檢測174.3.3支原體污染對細胞影響及污染物的檢測175抗凋亡策略在細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應用185.1 營養(yǎng)物質抗凋亡185.2 基因抗凋亡195.3 化學方法抗凋亡19參考文獻：20緒論1.1引言CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細胞，是目前生物工程上廣泛使用的細胞系。工業(yè)生產上應用較多的是CHO-K1細胞，為轉化細胞系，細胞染色體分布頻率是2n22，系亞二倍體細胞。ATCC保存CHO-K1細胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于

5、重組DNA蛋白的表達。由于該細胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉變?yōu)楣劝彼?_-半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細胞已經霍亂毒素適應，形態(tài)學有所改變。最初細胞為貼壁型細胞，經多次傳代篩選后，也可懸浮生長。1.2CHO細胞培養(yǎng)的特性CHO細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)，但其細胞結構和培養(yǎng)特性與微生物細胞相比，有顯著差別：動物細胞比微生物細胞大得多，無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差；倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養(yǎng)時須用抗生素；培養(yǎng)過程需氧量少(氧傳質系數(shù)kLa 大于10 h-1即可滿足每

6、毫升107 個細胞的生長)；培養(yǎng)過程中細胞相互粘連以集群形式存在；原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50 代即退化死亡；代謝產物具有生物活性，生產成.本高，但附加值也高。2.1DMEM培養(yǎng)基的組成與制備序號化合物名稱含量 (mg/L)序號化合物名稱含 量 (mg/L)1 無水氯化鈣200.0017 L-絲氨酸42.002 硝酸鐵 .9H2 O 0.1018 L-蘇氨酸95.003 氯化鉀400.0019 L-色氨酸16.004 無水硫酸鎂97.6720 L-酪氨酸鈉鹽104.005氯化鈉6400.0021 L-纈氨酸94.006 無水磷酸二氫鈉125.0022 D-泛酸鈣4.007 L-鹽酸精氨酸84.00

7、23 氯化膽堿4.008 L-鹽酸胱氨酸63.0024 葉酸4.009 L-谷氨酰胺584.0025 肌醇7.2010 甘氨酸30.0026 煙酰胺4.0011 L-鹽酸組氨酸42.0027 核黃素0.4012 L-異亮氨酸105.0028 鹽酸硫胺4.0013 L-亮氨酸105.0029 鹽酸吡哆辛4.0014 L-鹽酸賴氨酸146.0030 葡萄糖1000.0015 L-甲硫氨酸30.0031 丙酮酸鈉110.0016 L-苯丙氨酸66.0032 酚紅15.002.1.1DMEM培養(yǎng)基的組成將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水（水溫2030

8、）到950毫升，輕微攪拌溶解。 （1）加入2.438克碳酸氫鈉。 （2）輕微攪拌溶解，加注射用水至1升。 （3）用1mol / L 氫氧化鈉溶液或 1mol / L鹽酸溶液調pH至所需值。 （4）用0.2m濾膜正壓過濾除菌。 （5）溶液應在28下避光保存。2.2.1培養(yǎng)基的物理性質 無菌：無菌是保證培養(yǎng)細胞生存的首要條件。培養(yǎng)液不僅對細胞是高營養(yǎng)物，對細菌和霉菌也是高度營養(yǎng)物，細胞培養(yǎng)中如污染微生物，其繁殖比細胞快且能產生毒素使細胞死亡，因此細胞培養(yǎng)技術的關鍵之一是防止污染。污染微生物可來源于組織培養(yǎng)液、器皿、組織本身、工作者本身。因此，培養(yǎng)室的空氣等要徹底消毒，所有操作均要嚴格實行無菌操作，

9、各種物品拿入操作臺前應消毒，用灑精擦表面，用前于紫外線照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打開培養(yǎng)管前須在火焰上烙燒一下瓶口以使灰塵固定，操作時須將瓶、管斜放，吸管注入液體應避免和瓶口接觸，操作時禁止講話。 溫度：組織培養(yǎng)的最適溫度為35-37，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡。培養(yǎng)細胞對低溫的耐受力比高溫強。溫度增加2-3對細胞產生不良影響，使之在24小時死亡，溫度在43以上，細胞大多被殺滅，而低溫對細胞影響較小，細胞置于25-35時，細胞仍能生存和生長，但速度緩慢，放在4數(shù)小時之后，再置37培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長。 氣體：氣體也是細胞生存的必需條件之一。所需的氣

10、體主要有O2和CO2。O2參與三羧酸循環(huán)產生能量供給細胞生長、增殖和合成各種成分。CO2既是細胞代謝產物也是細胞所需成分。它主要與維持培養(yǎng)液pH值有直接關系。 pH值：多數(shù)細胞的適宜pH值為7.0-7.4，偏離此范圍對細胞可產生有害的影響。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽/ CO2。細胞代謝產生的各種酸使pH下降，而培養(yǎng)液中的NaHCO3產生CO2排入空間又使pH增加。 培養(yǎng)器皿的處理：培養(yǎng)器皿處理的好壞與否對于細胞的貼壁生長影響很大。它們只有貼附于不起化學作用的物體的表面時，才能生長、生存或維持功能。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料二大類。玻璃器皿一般須用清潔液浸泡1至7天，清水沖洗20次后

11、再用蒸餾水過洗2次，烤干備用。用前160高溫消毒2小時后使用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡4小時后，清水洗凈再用1N HCL浸泡4小時，用清水沖洗后再用蒸餾水漂洗，37干燥后，紫外線燈照射消毒；新橡皮塞須先用1/2NnaOH煮沸15分鐘，沖洗后再用4%HCL煮沸15分鐘，清水沖洗后用蒸餾水洗5次，煮沸10分鐘滅菌，或送高壓滅菌。 總之，細胞在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下可迅速增殖，但若遇到不良環(huán)境細胞會變圓，停止生長，甚至死亡，這是細胞的保護機制。綜上所述，細胞培養(yǎng)的基本條件主要包括了營養(yǎng)液、無菌條件、PH、溫度、氣體條件和培養(yǎng)器皿的清潔度。培養(yǎng)液水質配制培養(yǎng)液前要制備純凈的水。平衡鹽溶液組

12、織培養(yǎng)中所用的各種平衡鹽溶液主要有三個功效：作為稀釋和灌注的液體，維持細胞滲透壓;提供緩沖系統(tǒng)，是培養(yǎng)液的酸堿維持在培養(yǎng)細胞生理范圍內;提供細胞正常代謝所需的水分和無機離子。因此，平衡鹽溶液的組成和含量應符合如下條件：要與培養(yǎng)物來源的動物血清相近似；呈溶液狀態(tài)，利于物質的傳遞和擴散；是等滲的，否則會引起細胞的收縮（高滲透壓）和膨脹（低滲透壓）.2.2.2無血清培養(yǎng)無血清培養(yǎng)基(serum free medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細胞培養(yǎng)的要

13、求，但對有些實驗卻不適合，如觀察一種生長因子對某種細胞的作用，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細胞，以獲得它們的分泌產物。無血清培養(yǎng)基的基本配方:基本成分為基礎培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。以基礎培養(yǎng)基，并添加了維生素、轉鐵蛋白、乙醇胺、羥基丁酸鈉等成分。無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補充成分:激素和生長因子、結合蛋白、貼壁因子和擴展因子、低分子量營養(yǎng)因子、微量元素。特別需要強調的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無

14、血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。為了使細胞適應無血清培養(yǎng)，關鍵的是使所培養(yǎng)細胞： （1）處于對數(shù)生長中期 （2）90% 活細胞率 （3）適應時以較高的起始細胞接種3細胞培養(yǎng)方法與操作3.1細胞培養(yǎng)方法固定化培養(yǎng)方法在動物細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細胞的目的不僅僅要求催化活細胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)細胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細胞的活性顯得尤為重要。由于動物細胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會對動物細胞產生毒性，另外多糖(如卡拉膠等)由于具有很高

15、的離子強度也會對細胞產生毒害。微載體細胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術。這種培養(yǎng)技術是在生物反應器內加入培養(yǎng)液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒(微載體)，使細胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達6000 cm2，從而可實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng)。微載體的直徑在60250 靘，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質物質，因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。3

16、.1.1微載體培養(yǎng)原理與操作原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。攪拌轉速：由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度75r

17、/min。3.1.2蛋白質作基質的微載體 明膠微載體，用明膠水溶液與疏水性有機液體如礦物油，明膠混合即聚結成微珠，繼用戊二醛交聯(lián)，最后用NaBH4還原，即得到淡黃色明膠微載體。這種微載體，具有優(yōu)良的表面性質和光學性質，比重略大于水，基質是非剛性，無毒，能與多種細胞自然配位結合。特別是培養(yǎng)上皮形態(tài)細胞，如用其他基質微載體，收獲細胞非常困難，但用明膠微載體時，用膠原酶消化細胞-微載體，明膠即完全溶解于消化液中，游離細胞懸浮在液體上層，收獲很容易，且活細胞收率可達98%。所以，明膠微載體，是培養(yǎng)貼壁依賴細胞的一種優(yōu)良微載體。Corning GlassWorks新近修飾了明膠基質，合成新的明膠微載體，

18、培養(yǎng)后的細胞-微載體，用0.13%0。2%胰蛋白酶或0.4%Dispase溶液消化12分鐘，明膠珠即完全溶解。明膠微載體的缺點是能吸附或捕捉培養(yǎng)基中有效營養(yǎng)成分，特別是血清。3.2操作步驟3.2.1細胞的無血清馴化取處于對數(shù)生長期的貼壁CHO細胞，活率大于95%，開始進行無血清馴化。細胞馴化在轉瓶（spinner-bottle）中進行。將無血清細胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按1：1（V/V）的比例進行混合，接種密度為2105cells/ml的細胞，在37、5CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。 根據(jù)細胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代13代，接種密度維持在2105cells/ml。逐步提高無血清細胞

19、培養(yǎng)基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過程的細胞接種密度仍維持為2- 4105cells/ml。直至混合液中的血清濃度降低至0.1-0.2%，每一代的細胞活率大于90后，此時可將細胞完全培養(yǎng)在CHO無血清無動物組分培養(yǎng)基中。在CHO無血清無動物組分培養(yǎng)基中進行放大培養(yǎng)，建立起適應無血清無動物組分培養(yǎng)的CHO種子細胞庫。 連續(xù)適應分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉換到SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基中，與直接適應相比較，連續(xù)適應趨向對于細胞更加溫和一些。（1）以2倍正常接種密度接種生長活躍的物到75%有血清培養(yǎng)基：25SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)

20、。 （2）當細胞密度5105細胞/ml時，以2105到3105細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基為5050的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （3）以2106到3106細胞/ml細胞密度，25有血清培養(yǎng)基和75% SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （4）當細胞密度達到1106到3106細胞/ml（接種后4到6天），在100SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。 （5）每隔3到5天，當細胞密度達到1106到3106細胞/ml，細胞活率在90時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的物應該再次傳代培養(yǎng)。 建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應了

21、新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。3.2.2微載體培養(yǎng)種子細胞將上述CHO細胞（成功用無血清馴化后的細胞）用0.25%胰酶消化制成細胞懸液后，用培養(yǎng)基調整接種細胞濃度為3105/mL。沿導流管加入含明膠微載體和SAF-CHO-G-004細胞培養(yǎng)基的WhcltonBioster瓶罐中37，50 r/min 攪拌30分鐘靜置30分鐘（37

22、）。37，50 r/min 攪拌2分鐘再靜置24小時（37）（以利細胞貼附） 、37，50 r/min 持續(xù)攪拌培養(yǎng)每天換液1/23/4量，并取樣23mL，行染色計數(shù)連續(xù)培養(yǎng)三天細胞在明膠微載體上生長良好，經計數(shù)可達1106/ml細胞濃度，擴增了三倍?；具_飽和密度，此時可以消化傳代，進行擴大培養(yǎng)。3.2.3微載體培養(yǎng)的細胞傳代連續(xù)培養(yǎng)3天左右，細胞已基本在載體上鋪滿，已達飽和，此時為了擴大生產細胞，采用胰酶檸檬酸鹽消化，并進行高速攪拌，可成功地將CHO細胞從載體上解離，取樣檢查，計算解離率。即消化前先取樣染色計數(shù)的細胞數(shù)為分母，消化后取細胞懸液，計數(shù)的細胞數(shù)為分子，兩者進行比較即得解離率。結

23、果解離率可達69%，當細胞擴增至34倍時，消化解離效果好。解離的細胞又可擴大再吸附，再進行微載體懸浮培養(yǎng)，細胞密度又可達1106/mL。3.3半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應器內的總體積不變。 這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應器培養(yǎng)體積的1/23/4，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)，

24、隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩毎鲩L和產物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復培養(yǎng)，而無需反應器的清洗、消毒等一系列復雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細胞適應了生物反應器的培養(yǎng)環(huán)境和相當高的接種量，經過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細胞密度常常會提高。 用明膠微載體系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)的放大：可通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行在DMEM-無血清培養(yǎng)基中用半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 操作進行放

25、大。4細胞培養(yǎng)過程中檢測4.1細胞生長的檢測細胞計數(shù) 消化后的細胞要加入培養(yǎng)液中，制成一定濃度的細胞懸液，在分裝入培養(yǎng)容器之前，需計算出細胞懸液的濃度，即細胞數(shù)/L懸液。另外也應測定細胞生活狀態(tài)，區(qū)別出活細胞和死細胞數(shù)，只有活細胞才有效數(shù)值，計算出細胞濃度后，根據(jù)擬分裝的瓶數(shù)和所需濃度，再將細胞懸液稀釋進行培養(yǎng)?；铙w染色 臺盼藍活體染色簡單易行，是常用檢查細胞存活的方法，用臺盼藍染液，染后可見死細胞染成均勻的藍色，活體細胞不著色。細胞計數(shù) 用血球計數(shù)板做細胞計數(shù)。根據(jù)情況用營養(yǎng)液稀釋與否均可。做法是用吸管吸取少許染色的細胞懸液滴于計數(shù)板上，使懸液自由充滿蓋片下方間隙，勿留氣泡。稍后片刻，鏡下觀

26、察并計算出四角大格內的細胞數(shù)，壓線只計上線和右線的細胞，然后按下式計算出細胞濃度：細胞數(shù)/L原液=四角大格內的細胞總數(shù)/4*10000*稀釋倍數(shù)4.2細胞常數(shù)檢查細胞生長 初代組織培養(yǎng)或細胞懸液接種以后，都有一個長短不同的潛伏期。一般在第二天就可見細胞生長，一周就可接連成片。細胞生長的四個階段游離期：剛接種后，細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)，此時細胞胞質回收，胞體變圓形。吸附期：為細胞貼附于培養(yǎng)壁過程。繁殖期：生長期。退化期：當細胞長滿瓶壁以后，如不及時做傳代，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，細胞進入退化期。細胞形態(tài) 生長良好的細胞，在一般顯微鏡下觀察時透明度大，輪廓不清，只有用相差顯微鏡，才能看見細胞

27、的細微形態(tài)。營養(yǎng)液：在正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色4.3CHO細胞培養(yǎng)內污染物的檢測4.3.1細菌污染對培養(yǎng)細胞的影響及污染物的檢測常見的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯影響，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細胞有細菌污染時，取10ml細胞懸液離心1000轉5分鐘，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml,將細胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。如果培養(yǎng)無真的細菌污染，24小時內可以獲得陽性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數(shù)時，大約每20分鐘一代，會使培養(yǎng)系統(tǒng)中很快產生大量細菌，后者不僅可以消耗培養(yǎng)系統(tǒng)中的養(yǎng)分，還能釋

28、放大量代謝產物。幾個小時后，增殖的細菌就可以導致培養(yǎng)液外觀渾濁，肉眼就可以判斷。細菌污染大多數(shù)可以改變培養(yǎng)液pH，使培養(yǎng)液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀察，可見滿視野都是點狀的細菌顆粒，原來的清晰培養(yǎng)背景變得模糊，大量的細菌甚至可以覆蓋細胞，對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。4.3.2真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態(tài)各異，但是污染后易于發(fā)現(xiàn)，大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面，肉眼可見；有的散在生長，鏡下可見呈絲狀、管狀、樹枝狀，縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形，散在細胞周邊和細胞之間生長。真菌生長迅速，能在短

29、時間內抑制細胞生長、產生有毒物質殺死細胞?？拐婢苿︻A防和排除真菌污染有效。4.3.3支原體污染對細胞影響及污染物的檢測細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題,是細胞培養(yǎng)最常見的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被察覺，有些污染的細胞仍在被應用。研究表明，95以上是以下四種：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養(yǎng)的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種

30、以上的支原體。據(jù)查，目前各實驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。5抗凋亡策略在細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應用 生物反應器動物細胞大規(guī)模生產過程中，細胞凋亡在細胞死亡中占主要部分。最近研究顯示在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中，細胞死亡是維持細胞高活性和高密度的最大障礙。理論上講，防止或延長細胞死亡，可以極大提高生物反應器生產重組蛋白的產量。 細胞凋亡由一系列基因精確地調控，是多細胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理現(xiàn)象。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識別一個4氨基酸序列，并在

31、識別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識別的序列，可以切割活化自身而導致信號放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級聯(lián)放大，最終作用于效應蛋白，引起細胞凋亡。 5.1 營養(yǎng)物質抗凋亡 在常規(guī)生物反應器構造中，營養(yǎng)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長因子則引起凋亡，例如血清，糖或特殊氨基酸的耗盡。培養(yǎng)基中添加氨基酸或其它關鍵營養(yǎng)可抑制凋亡、延長培養(yǎng)時間從而提高產品的生產。大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質的耗竭或代謝產物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基

32、中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 5.2 基因抗凋亡 與凋亡相關的一系列基因產物可對其進行正、負向的調控，因此可通過導入相應基因來調節(jié)細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現(xiàn)出很強的抗凋亡活性。 5.3 化學方法抗凋亡 凋亡發(fā)生時細胞許多部位發(fā)生生化物質的改變，有些變化如改變細胞氧化還原條件產生活性氧在凋亡信號階段發(fā)生，其它的如破壞線粒體膜電位、激活caspase則發(fā)生在凋亡效應階段，這在絕大多數(shù)細胞死亡中是相同的。因此,阻止這些生化物質的改變可能阻止或至少延遲細胞凋亡的發(fā)生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發(fā)生，被認為是抗調亡策略之一。展望通過幾十年的發(fā)展至今，CHO細胞已成為生物技術藥物最重要的表達或生產系統(tǒng)，這種局面人將持續(xù)并且其所占比例有逐年增大趨勢。CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術及其生物反應器工程可廣泛應用于抗體、基因重組蛋白質藥物、病毒疫苗等生物技術產品的研究開發(fā)和工業(yè)化生產。國家重點實驗室在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術及其生物反應器工程研究和開發(fā)應用方面，長期以來得到國家重大科技攻關計劃、863計劃等的大力支持，擁有一支精干的研究開發(fā)團隊