CRISPRCas9監(jiān)督復(fù)合體

1、Directional R-Loop Formation by the CRISPR-Cas Surveillance Complex Cascade Provides Efficient Off-Target Site RejectionCRISPR-Cas 監(jiān)督復(fù)合體（Cascade） 提供有效的抑制脫靶位點(diǎn)的定向R-loop形成一、Background:以CRISPR/Cas9 作為例子，解釋這種復(fù)合體是如何靶向編輯基因的。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被稱(chēng)為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，實(shí)際

2、上就是一種基因編輯器，是細(xì)菌用以保護(hù)自身對(duì)抗病毒的一個(gè)系統(tǒng)，也是一種對(duì)付攻擊者的基因武器。后來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，它似乎是一種精確的萬(wàn)能基因武器，可以用來(lái)刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，這些目標(biāo)基因包括人、老鼠、斑馬魚(yú)、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲(chóng)和農(nóng)作物細(xì)胞內(nèi)的基因，這也意味著基因編輯器是一種可以廣泛使用的生物技術(shù)。 CRISPR擔(dān)當(dāng)細(xì)菌的防護(hù)罩CRISPR簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其序列由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個(gè)間隔區(qū)(Spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于CRISPR簇上游，是富含AT長(zhǎng)度為3005

3、00bp的區(qū)域，被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動(dòng)子序列。重復(fù)序列區(qū)長(zhǎng)度為2148bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長(zhǎng)度為2672bp的間隔區(qū)隔開(kāi)。Spacer區(qū)域由俘獲的外源DNA組成，類(lèi)似免疫記憶，當(dāng)含有同樣序列的外源DNA入侵時(shí)，可被細(xì)菌機(jī)體識(shí)別，并進(jìn)行剪切使之表達(dá)沉默，達(dá)到保護(hù)自身安全的目的。通過(guò)對(duì)CRISPR簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個(gè)多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPR associated)，縮寫(xiě)為Ca

4、s。目前發(fā)現(xiàn)的Cas包括Cas1Cas10等多種類(lèi)型。Cas基因與CRISPR共同進(jìn)化，共同構(gòu)成一個(gè)高度保守的系統(tǒng)。 CRISPR的工作原理當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的RNA前體(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類(lèi)型即I型、II型和III型，它們存在于大約40%已測(cè)序的真細(xì)菌和90%已測(cè)序的古細(xì)菌中。其中II型的組成較為簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白以及向?qū)NA(gRNA)為

5、核心組成，也是目前研究中最深入的類(lèi)型。在II型系統(tǒng)中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨(dú)參與。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質(zhì)中部的HNH2個(gè)獨(dú)特的活性位點(diǎn)，在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來(lái)，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，識(shí)別并結(jié)合于crRNA互補(bǔ)的序列，然后解開(kāi)DNA雙鏈，形成R-loop，使

6、crRNA與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點(diǎn)剪切crRNA的互補(bǔ)DNA鏈，RuvC活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPRCas9的剪切位點(diǎn)位于crRNA互補(bǔ)序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5-GG-N18-NGG-3特征區(qū)域中的NGG位點(diǎn)，而這種特征的序列在每128bp的隨機(jī)DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。研究結(jié)果表明，Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質(zhì)粒，其剪切效率堪比限制性?xún)?nèi)切酶。 修復(fù)有兩種機(jī)制：HDR：同源重組修復(fù)，DSB出現(xiàn)之后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)這種修復(fù)機(jī)制，以同源鏈為模板，對(duì)

7、DSB進(jìn)行修復(fù)。由于這種修復(fù)作用是以同源鏈為模板，而且還有位點(diǎn)特異性的核酸酶（site-specificnuclease）參與，所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一個(gè)或者多個(gè)基因，也可以進(jìn)行單堿基替換。NHEJ：非同源末端連接修復(fù)機(jī)制是另外一種DSB修復(fù)機(jī)制，通過(guò)這種修復(fù)可以將斷裂的DSB末端直接連接起來(lái)。由于在這種修復(fù)過(guò)程中不會(huì)用到同源模板鏈，所以在斷裂處容易出現(xiàn)小的插入或者缺失突變，常常會(huì)導(dǎo)致移碼突變，使基因的功能遭到破壞。二、R-loop:如下圖，已形成好了的Cascade復(fù)合體，先進(jìn)行PAM序列識(shí)別，之后堿基互補(bǔ)配對(duì)會(huì)驅(qū)使R-loop形成，并且推進(jìn)R-loop的延伸擴(kuò)展，這時(shí)候另一

8、端的反超螺旋就會(huì)增加。而在延伸的過(guò)程中，由于會(huì)遇到與自身的protospacer（也就是以前的記憶）不相符合的地方，會(huì)導(dǎo)致R-loop不能locking或者崩潰瓦解掉。如果進(jìn)行順利，到達(dá)protospacer的末端時(shí)，R-loop就會(huì)locking住，然后進(jìn)行DNA的剪切。三、靶向識(shí)別雙向通訊模型如下圖，首先Cse1識(shí)別PAM序列，起始R-loop，之后推進(jìn)R-loop的擴(kuò)展延伸，這個(gè)時(shí)候R-loop的崩潰瓦解可能性是逐漸減小的。接著延伸的過(guò)程中，會(huì)遇到一些不能堿基互補(bǔ)配對(duì)的突變（off-target），這時(shí)候它要么瓦解，要么就容忍下來(lái)，繼續(xù)推進(jìn)接收器cse2到protospcer的末端，并且locking住，形成的構(gòu)象變化可反饋給PAM，這樣招募Cas3進(jìn)行DNA剪切。它們認(rèn)為這樣的模型是雙向通訊的，并且是有一定的容錯(cuò)性的。突變（off_target）四、R-loop的定量檢測(cè)就是用磁珠連接DNA，通過(guò)磁力可以影響磁珠并且扭動(dòng)DNA，而形成plectonemic superhelix，這樣就會(huì)使得DNA長(zhǎng)度變化。而因R-loop的形成，又會(huì)引起DNA長(zhǎng)度的改變，通過(guò)video microscopy就可以檢測(cè)到，這樣來(lái)觀察R-lo