實驗五耐高溫酵母菌株的誘變選育

1、實驗一 耐高溫酵母菌株的誘變選育一、目的要求通過實驗，觀察紫外線對酵母菌的誘變效應，學習物理因素誘變育種的方法。二、基本原理紫外線對微生物有誘變作用，主要引起是DNA的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體），從而引起菌體遺傳性變異。測定紫外光的劑量有直接法（以爾格/平方毫米表示絕對劑量）和間接法（以輻照時間或致死率作為相對劑量）兩種。微生物所受射線的劑量決定于燈的功率、照射距離和時間。如果功率和距離是固定的話，則劑量就和照射的時間成正比，故照射時間的長短可作為相對劑量。一般用15W的紫外燈，距離固定在左右，選用致死率達9099.9%所需的輻射時間進行誘變處理。但

2、各類微生物所需的最適時間不同，一般營養(yǎng)體需輻照35分鐘，芽孢要10分鐘，芽孢桿菌的營養(yǎng)體要13分鐘，革蘭氏陽性菌和無芽孢菌較易殺死，用30秒，放線菌的分生孢子用30秒2分鐘。輔射不宜在肉湯等成分復雜的液體中進行，以免化學反應的干擾；同時要有電磁攪拌設備，以求照射均勻，尤其在菌液濃度較大或菌體、孢子等較大而重時很容易在處理期間發(fā)生沉降，此時電磁攪拌更顯重要。照射前紫外燈宜先開燈預熱2030分鐘，使光波穩(wěn)定。三菌種與儀器菌種：酵母菌 儀器：血球計數(shù)板，顯微鏡，紫外線燈（15W），電磁攪拌器，離心機 四實驗設計（1）菌懸液的制備（a）取培養(yǎng)24小時的酵母菌的斜面1支，用無菌生理鹽水將菌苔洗下，并倒入

3、盛有玻璃珠的大試管中，振蕩30分鐘，以打碎菌塊。（b）將上述菌液離心（1500r/min，離心5分鐘），棄去上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌23次，最后制成菌懸液。（c）用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為每毫升108個。（2）馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至55左右時倒平板，凝固后待用。（3）紫外線處理（a）將紫外線燈開關打開預熱約20分鐘。（b）取直徑9cm無菌平皿1套，分別加入上述菌懸液67ml，并放入無菌大頭針于平皿中。（c）將盛有菌懸液的1平皿置于磁力攪拌器上，在距離為30cm，功率為15W的紫外線燈下分別攪拌照射30s，60s，90s，120s，150s，180s。(4) 稀釋在紅燈

4、下，將上述經(jīng)誘變處理的菌懸液以10倍稀釋法稀釋成10-1-10-6（具體可按估計的存活率進行稀釋）。(5)涂平板取10-5、10-6、10-7三個稀釋度涂平板，每個稀釋度涂平板3只，每只平板加稀釋菌液01ml，用無菌玻璃刮棒涂勻。以同樣操作，取未經(jīng)紫外線處理的菌稀釋液涂平板作對照。(6)培養(yǎng)將上述涂勻的平板，靜置2min后，用黑布（或黑紙）包好，置36、42、50三個不同溫度下培養(yǎng)24小時。注意每個平皿背面要標明處理時間和稀釋度。(7)計數(shù)將培養(yǎng)24小時后的平板取出進行計數(shù)，根據(jù)對照平板上菌落數(shù)，計算1.不同溫度下菌的存活率2.不同紫外線處理時間菌的存活率3.同一溫度下稀釋倍數(shù)的準確性五實驗結(jié)果的觀察與記錄將實驗結(jié)果填入表8 六思考題 (1) 用于誘變的菌懸液（或孢子懸液）為什么要充分振蕩？(2) 經(jīng)紫外線處理后的操作和培養(yǎng)為什么要在暗處或紅光下進行？稀釋倍數(shù)平均菌落處理時間 （個數(shù)/皿）溫度10-510-610-7存活率%致死率%360（對照）306090120150180420（對照）306090120150180500（對