實驗十 人類染色體G顯帶技術(shù)及G帶核型分析

1、.實驗十 人類染色體G顯帶技術(shù)及G帶核型分析實驗?zāi)康?、初步掌握染色體G帶標本的制備技術(shù)。2、了解人類染色體的G顯帶的帶型特征。實驗用品1、材料：常規(guī)方法制備的中期人類染色體標本（標本片齡不超過30天為宜）。2、器材：顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、烤箱、恒溫水浴箱、冰箱、染色缸、小鑷子、玻片架、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙。3、試劑：0.125胰蛋白酶溶液、0.02EDTA溶液、胰蛋白酶一EDTA混合液、0.85生理鹽水、蒸餾水、Giemsa原液、Giemsa稀釋液、115mol L磷酸緩沖液。實驗原理人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋

2、的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)（banding technique）。本世紀70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，且在眾多的顯帶技術(shù)中（Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶），G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。因為它主要是被Giemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標本經(jīng)胰蛋白酶、Na0H、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色，可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋，這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細微的結(jié)構(gòu)畸變。關(guān)于G顯帶的機理目前有多種說法，例如，Lee等（

3、1973）認為染色體上與DNA結(jié)合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區(qū)段成為淺帶，而那些組蛋白和DNA結(jié)合牢固的區(qū)段可被染成深帶。有人認為，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時，就能直接觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來的帶特點也不一樣，說明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。一般認為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色體節(jié)段，相反，含GC多的染色體段則不易著色?？偟膩碚f，G顯帶的機理還未搞清。內(nèi)容與方法一、人類染色體G顯帶標本制備1、胰蛋白酶法將常規(guī)制備的人染色體玻片標本（未染色的白片）置70烤箱中處

4、理2小時，然后轉(zhuǎn)入37培養(yǎng)箱中備用，一般在第37天進行顯帶。取2.5的胰蛋白酶原液2.5ml加生理鹽水至50ml，配成0.125的工作液并用NaHCO3調(diào)pH值至7左右。將配好的胰蛋白酶工作液放入37水浴箱中預(yù)熱。將玻片標本浸入胰蛋白酶中，不斷擺動使胰蛋白酶的作用均勻，處理12分鐘（精確的時間自行摸索）。立即取出玻片，放入生理鹽水中漂洗兩次。染色。將標本浸入37預(yù)溫的Giemsa染液（1:10的Giemsa原液和pH6.8的磷酸緩沖液）中染色10分鐘左右。自來水沖洗（用細水小心沖洗）、晾干。鏡檢顯帶效果。在低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相轉(zhuǎn)換油鏡觀察，若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足；若

5、染色體邊緣發(fā)毛為顯帶過頭，此時應(yīng)根據(jù)具體情況增減胰蛋白酶處理時間重新處理一張標本。2、EDTA一胰蛋白酶法取25ml生理鹽水和25ml0.02的EDTA溶液倒入立式染色缸中混勻。取2.5的胰蛋白酶原液1ml加入到上液中混勻，并用5NaHCO3調(diào)pH值至7左右。置水浴箱預(yù)溫至37。將染色體標本片浸入胰蛋白酶一EDTA溶液中處理520秒，同時輕輕搖動玻片。取出標本立即浸入生理鹽水中洗兩次。浸入37的Giemsa染液中染色510分鐘。細水沖洗后晾干、鏡檢。二、正常人各染色體的G帶特征A組：13號染色體。1號染色體。短臂：近側(cè)段有2條深帶，第2深帶稍寬，在處理較好的標本上，遠側(cè)段可顯出34條淡染的深帶

6、。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的第1深帶為lp 21；第2深帶為1p31。長臂：副縊痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠側(cè)為一寬的淺帶，近中段與遠側(cè)段各有兩條深帶，此中段第2深帶染色較濃，中段兩條深帶稍靠近，此臂分為4個區(qū)，副縊痕遠側(cè)的淺帶為lp21號帶、中段第2深帶為lp31號帶，遠側(cè)段第1深帶為lp41號帶。2號染色體。短臂：可見4條深帶，中段的2條深帶稍靠近，此臂分為2個區(qū)，中段兩條深帶之間的淺帶為2p21。長臂：可見7條深帶，第3和第4深帶有時融合。此臂分為3個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2p21帶，第4和第5深帶之間的淺帶為2p31號帶。3號染色體。在長臂與短臂的近中段各具有1條明顯的寬的淺帶。短臂

7、：一般在近側(cè)段可見1條較寬的深帶，遠側(cè)段可見2條深帶，其中遠側(cè)1條較窄，且著色淡，這是區(qū)別3號染色體短臂的顯著特征。在處理較好的標本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，此臂分2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。長臂：一般在近側(cè)段和遠側(cè)段各有1條較寬的深帶，在處理好的標本上，近側(cè)段的深帶可分為2條深帶，遠側(cè)段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1帶。該染色體的G帶圖有點象蝴蝶結(jié)。B組：45號染色體。4號染色體短臂：可見2條深帶，近側(cè)深帶染色較淺，短臂只有1個區(qū)。長臂：可見均勻分布的4條深帶，在處理較好的標本上，遠側(cè)段的2條深帶可各自分為2條較寬的深帶。此臂分為3區(qū)，近側(cè)段第1和第2深帶之間的

8、淺帶為2區(qū)1帶，遠側(cè)段兩條深帶之間的淺帶為3區(qū)1帶。5號染色體短臂：可見2條深帶，其遠側(cè)的深帶寬且著色濃，此臂僅1個區(qū)。長臂：近側(cè)段2條深帶，染色較淡，有時不明顯，中段可見3條深帶，染色較濃，有時融合成1條寬的深帶，遠側(cè)段可見2條深帶，近末端的1條著色較濃，此臂分為3個區(qū)，中段第2深帶為2區(qū)l帶，中段深帶與遠側(cè)深帶之間的寬闊的淺帶為3區(qū)1帶。C組：612號和X染色體6號染色體短臂：中段有1條明顯寬闊的淺帶，形如“小白臉”，是此染色體的特征，近側(cè)段和遠側(cè)段各有1條深帶，近側(cè)深帶貼著絲粒。在處理較好的標本上，遠側(cè)段的深帶可分為兩條深帶。此臂分為2個區(qū)，中段的明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見5條

9、深帶，近側(cè)1條緊貼著絲粒，遠側(cè)末端的1條深帶著色較淡；此臂分為2個區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。7號染色體著絲粒著色濃。短臂：有3條深帶，中段深帶著色較淡，有時不明顯，遠測深帶著色濃，形似“瓶塞”。此臂分為2個區(qū)，遠側(cè)段的深帶為2區(qū)1帶。長臂：有3條明顯深帶，遠側(cè)近末端的1條著色較淡；第2和第3帶稍接近。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)1帶、中段的第2深帶為3區(qū)1帶。8號染色體。短臂：有2條深帶，中段有1條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相鑒別的主要特征。此臂分為2個區(qū)，中段的淺帶為2區(qū)1帶。長臂：可見3條分界極不明顯的深帶，此臂分2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。9號染色體著絲粒著色

10、濃。短臂：近側(cè)段和中段各有1條深帶，在處理較好的標本上，中段可見2條較窄的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。長臂：可見明顯的2條深帶，次縊痕一般不著色，在有些標本上呈現(xiàn)出特有的頸部區(qū)。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)的1條深帶為2區(qū)1帶，遠側(cè)的1條深帶為3區(qū)1帶。10號染色體著絲粒著絲濃。短臂：近側(cè)段和近中段各有1條深帶，在有些標本上近中段可見2條深帶，但與8號染色體短臂比較，其上深帶的分界欠清晰。此臂只有1個區(qū)。長臂：可見明顯的3條深帶，遠側(cè)段的2條深帶稍靠近，這是與8號染色體相鑒別的一個主要特征，此臂分為2個區(qū)，近側(cè)段的1條深帶為2區(qū)1帶。11號染色體短臂：近中段可見1條深帶，在處理較好的標本

11、上，這條深帶可分為3條較窄的深帶。此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有1條深帶，緊貼著絲粒。遠側(cè)段可見1條明顯的較寬的深帶，這條深帶與近側(cè)的深帶之間是1條寬闊的淺帶，這是與12號染色體相鑒別的一個明顯的特征，在處理較好的標本上，遠側(cè)段的這條較寬的深帶可分為2條較窄的淺帶，兩深帶之間有1條很窄的淺帶，一般極難辨認，但它是分區(qū)的一個界標，在有些標本上近末端處可見1條窄的淡染的深帶。此臂分2個區(qū)，上述遠側(cè)兩條深帶之間的那條很窄的淡帶為2區(qū)1帶。12號染色體短臂：中段可見1條深帶，此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)有1條深帶，緊貼著絲粒，中段有1條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有1條明顯的淺帶，但與11號染色體比較

12、這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個主要特征。在處理較好的標本上，中段這條較寬的深帶可分為3條深帶。其正中一條著色較濃，在有些標本上，遠側(cè)段還可以看到l2條染色較淡的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段正中的深帶為2區(qū)1帶。X染色體其長度介于7號和8號染色體之間，主要特點是長臂和短臂中段各有1條深帶，有“一擔挑”之名。短臂：中段有一明顯的深帶，宛如竹節(jié)狀。在有些標本上遠側(cè)段還可以看見1條窄的著色淡的深帶，此臂分為2個區(qū)，中段的深帶為2區(qū)1帶。長臂：看見34條深帶，近中部1條最明顯，此臂分為2個區(qū)，近中段的深帶為2區(qū)1帶。D組：1315號染色體，具有近端著絲粒和隨體。13號染色體著絲粒區(qū)深染。

13、長臂：可見4條深帶，第1和第4深帶較窄，染色較淡；第2和第3深帶較寬，染色較濃。此臂分為3個區(qū)，第2深帶為2區(qū)1帶，第3深帶為3區(qū)1帶。14號染色體著絲粒區(qū)深染。長臂：近側(cè)和遠側(cè)各有1條較明顯的深帶。在處理較好的標本上，中段尚看見1條著色較淺的深帶。此臂分為3個區(qū)，近側(cè)深帶為2區(qū)1帶，遠側(cè)深帶為3區(qū)1帶。15號染色體著絲粒區(qū)深染。長臂：中段有一條明顯深帶；染色較濃，有的標本上近側(cè)段可見l2條淡染的深帶。此臂分為2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。E組：16一18號染色體16號染色體短臂：中段有1條深帶，在較好的標本上看見2條深帶，此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)段和遠側(cè)段各有1條深帶。有時遠側(cè)段1條不明顯，

14、次縊痕著色濃；此臂分2個區(qū)，中段深帶為2區(qū)1帶。17號染色體短臂：有1條深帶，緊貼著絲粒，此臂只有1個區(qū)。長臂：遠側(cè)段看見1條深帶，這條深帶與著絲粒之間為一明顯而寬的淺帶，此臂分為2個區(qū)，這條明顯而寬的淺帶為2區(qū)1帶。18號染色體短臂：一般為淺帶，此臂只有1個區(qū)。長臂：近側(cè)和遠側(cè)各有1條明顯的深帶，此臂分為2個區(qū)，兩深帶之間的淺帶為2區(qū)1帶。19號染色體著絲粒及其周圍為深帶，其余為淺帶。短臂和長臂均只有1個區(qū)。20號染色體著絲粒區(qū)濃染。短臂有一條明顯的深帶，此臂只有1個區(qū)。長臂：中段和遠側(cè)段看見12條染色較淡的深帶，有時全為淺帶。此臂只有1個區(qū)。此染色體有“頭重腳輕”之名。G組；2122號染色

15、體和Y染色體，21、22號有隨體。21號染色體著絲粒區(qū)著色淡。其長度比22號短，其長臂上有明顯而寬的深帶。此臂分2個區(qū)，其深帶為2區(qū)1帶。22號染色體著絲粒區(qū)染色濃。其長度比21號長，在長臂上可見2條深帶，近側(cè)的1條著色濃，而且緊貼著絲粒。近中段的1條著色淡，在有的標本上不顯現(xiàn)。此臂只有1個區(qū)。Y染色體長度變化大，有時整個長臂被染成深帶，在處理好的標本上可見2條深帶。此臂只有1個區(qū)。三、鏡下帶型分析每人用自己所作的G顯帶標本，選擇分散好，染色體帶型清晰的分裂相，在油鏡下根據(jù)上述G顯帶各號染色體的特征，依次找出1至22號染色體和性染色體，繪成草圖。各染色體的位置、形狀大小盡量真實（不必繪出帶型）。并在各染色體旁邊標明染色體序號。四、正常人染色體G帶照片分析1、在G帶染色體顯微攝