土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),課題背景,1、尿素的利用,尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、細(xì)菌利用尿素的原因,土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕?3、課題的目的-土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù),從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌,統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌,一.研究思路,.篩選菌株,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目,.設(shè)置對(duì)照,1、實(shí)例：,DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。,.篩選菌株,提出的問題 如何尋找耐高溫的酶？ 解

2、決問題的思路尋找耐高溫環(huán)境；,啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。,原理高溫淘汰其他菌，選出耐高溫細(xì)菌，耐高溫菌種提取耐高溫酶。,2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：,人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。,什么是選擇性培養(yǎng)基？,篩選的方法,利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行分離,請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：,從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類？,固體培養(yǎng)基,在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,問：培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理是什么？,培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能

3、分解尿素,問 怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？,以尿素為 唯一氮源 的培養(yǎng)基,牛肉膏 蛋白胨 培養(yǎng)基,是,分離 尿素 細(xì)菌,作對(duì)照 判斷實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基 有無選擇性,只生長(zhǎng)分解尿素的細(xì)菌,生長(zhǎng)多種微生物,是,1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：,利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。,.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：,不能區(qū)分死菌與活菌； 不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)； 需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度； 個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察；,缺點(diǎn),2.間接計(jì)數(shù)法（活菌計(jì)數(shù)法） 原理：在稀釋度足夠高時(shí)，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的，即一個(gè)菌落代表原先的一個(gè)單細(xì)胞。 常用方法：稀釋涂布平板法。,每克樣

4、品中的菌落數(shù)(CV)M 其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。,注意事項(xiàng) 為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。 為使結(jié)果接近真實(shí)值可將同一稀釋度加到三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。,設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。,.設(shè)置對(duì)照：,實(shí)例：在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌 落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106 倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌 落，但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 只選擇出大約50

5、個(gè)菌落。分析其原因。,原因：土樣不同， 培養(yǎng)基污染或操作失誤 (或者是混入了其他的含氮物質(zhì)),小結(jié)：通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。,方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn),方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。,結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容：包括對(duì)實(shí)驗(yàn)方案、儀器、材料、用具和藥品，具體的實(shí)驗(yàn)步驟及時(shí)間安排等的綜合考慮和安排。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求：周密細(xì)致。,實(shí)驗(yàn)流程,土壤取樣 制備培養(yǎng)基 樣品稀釋

6、 取樣涂布 微生物的培養(yǎng)與觀察 細(xì)菌的計(jì)數(shù),實(shí)驗(yàn)操作,（1）土壤取樣： 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣。將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。,注意事項(xiàng)： 無菌操作：鐵鏟和信封都要滅菌。后面稱取土壤、將稱好的土樣倒入錐形瓶、稀釋土壤溶液，每一步都要在火焰旁操作。,實(shí)驗(yàn)操作,（2）制備培養(yǎng)基： 制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可作為對(duì)照，判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。將菌液稀釋103107倍。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，一個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。準(zhǔn)備8支滅菌的試管和1支滅菌的移液管。,實(shí)驗(yàn)操作,（3

7、）樣品稀釋： 將10g土樣加入盛有90ml無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻，吸取上清液1ml，轉(zhuǎn)移至盛有9ml生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度。,實(shí)驗(yàn)操作,（4）微生物的培養(yǎng)與觀察 按照由107103稀釋度的順序分別吸取0.1 ml菌液涂布平板，按照濃度從低到高的順序涂布平板，然后將平板置于30培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d。 每隔24h比較一次牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅指示劑的培養(yǎng)基的斜面上，觀察能否產(chǎn)生顏色反應(yīng)。,注意事項(xiàng)： 做好標(biāo)記：本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多。為避免混淆，最好在使用前就做好標(biāo)記。例如，在

8、標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)，應(yīng)注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 在進(jìn)行系列稀釋的時(shí)候，為避免試管相互混淆，可以將已經(jīng)進(jìn)行過稀釋操作的試管，按稀釋度遞增的順序，依次放置在試管架的另一行。這樣，試管的位置就能清楚地表示出稀釋進(jìn)行到哪一步。,實(shí)驗(yàn)操作,（5）細(xì)菌的計(jì)數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),1、培養(yǎng)物中是否有雜菌污染,對(duì)照的培養(yǎng)皿中無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基未被雜菌污染。反之，則被雜菌污染。,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),2、選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落,

9、牛肉膏培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),3、樣品的稀釋操作是否成功,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),4、重復(fù)組的結(jié)果是否一致,如果不同同學(xué)選取的是同一種土樣，統(tǒng)計(jì)的結(jié)果應(yīng)該接近。如果結(jié)果相差太遠(yuǎn)，需要分析產(chǎn)生差異的原因。,二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。 .制備培養(yǎng)基： 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。,應(yīng)在火焰旁

10、稱取土壤10g。 在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行,三樣品的稀釋,.取樣涂布,實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。,.取樣涂布,分離不同的微生物采用不同的稀釋度,原因：不同微生物在土壤中含量不同,.微生物的培養(yǎng)與觀察,思考：要將哪些培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)？,.微生物的培養(yǎng)與觀察,在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。,培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。 細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d 放線菌：2528培養(yǎng)57d 霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。,如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目

11、在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。,微生物的培養(yǎng)與觀察,三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 1.通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。 2.提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。,四、操作提示,無菌操作,做好標(biāo)記,規(guī)劃時(shí)間,五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示

12、劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。,測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍(lán) 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。,大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤,大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征,本課題知識(shí)小結(jié):,1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別 3.能合成脲酶的微生物所需

13、要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,實(shí)踐訓(xùn)練,A,C,D,4.下列說法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。 5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽,B,C,例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。