幾種菌種的保存及復(fù)蘇方法;

1、幾種菌種的保存及復(fù)蘇方法（含擴(kuò)增方法）定期移植法，亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，包括斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等。是指將菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，待生長(zhǎng)充分后，于46進(jìn)行保存并間隔一定時(shí)間進(jìn)行移植培養(yǎng)的菌種保藏方法。操作步驟如下：1 培養(yǎng)基制備1.1 器皿準(zhǔn)備培養(yǎng)基制備過(guò)程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、燒杯、吸管等，經(jīng)洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。1.2 溶解培養(yǎng)基配料先在燒杯中放適量水，按培養(yǎng)基配方稱取各項(xiàng)材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。1.3 調(diào)ph值配料溶解后將培養(yǎng)基冷卻至室溫，根據(jù)要求加稀酸（0.1m

2、ol/l鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調(diào)ph值。加酸或堿液時(shí)要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過(guò)堿或過(guò)酸而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確和營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。1.4 加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。1.5 過(guò)濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過(guò)濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(45ml)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過(guò)程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。1.6 包扎標(biāo)記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。1.7 滅菌根據(jù)要求將培養(yǎng)基滅菌，通常

3、蒸汽滅菌為121，1520min。1.8 斜面擺放滅菌后及時(shí)擺放斜面，斜面長(zhǎng)度不超過(guò)試管管長(zhǎng)的二分之一為宜。1.9 無(wú)菌檢查將滅菌的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中作無(wú)菌檢驗(yàn)，通常30培養(yǎng)13天。無(wú)菌檢查合格后將其保存于4下備用。2 接種2.1 斜面接種2.1.1 點(diǎn)接把菌種點(diǎn)接在斜面中部偏下方處。適用于擴(kuò)散型生長(zhǎng)及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2 中央劃線從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴(kuò)散的細(xì)菌，也適用于部分真菌。2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量

4、菌體細(xì)胞，適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.1.5 挖塊接種法挖取菌絲體連同少量培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔(dān)子菌類真菌。2.2 穿刺接種用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細(xì)菌和酵母菌等。2.3 液體接種挑取少量固體斜面菌種或用無(wú)菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養(yǎng)基中。3 培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中，在適宜的條件下培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定期或得到成熟孢子。細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般為3037，真菌培養(yǎng)溫度一般為2528。4 保藏培養(yǎng)好的菌種于46保存，根據(jù)要求每36個(gè)月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊

5、酵母，棉病囊霉等，須13個(gè)月移植一次。保藏濕度用相對(duì)濕度表示，通常為50%70%。斜面菌種應(yīng)保藏相繼三代培養(yǎng)物以便對(duì)照，防止因意外和污染造成損失。液體石蠟保藏法亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至菌種長(zhǎng)出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個(gè)斜面，再直立放置于低溫（46）干燥處進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法。操作步驟如下：1 液體石蠟的準(zhǔn)備選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進(jìn)行滅菌：121濕熱滅菌30min，置40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無(wú)菌檢查后備用。160干熱滅菌2個(gè)小時(shí)，冷卻后，經(jīng)無(wú)菌檢查后備

6、用。2 斜面培養(yǎng)物的制備參照定期移植法。3 灌注石蠟將無(wú)菌的液體石蠟在無(wú)菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。4 保藏4.1注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（46）干燥處保藏，保藏時(shí)間210年。4.2保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充無(wú)菌的液體石蠟。5 恢復(fù)培養(yǎng)恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)，挑取少量菌體轉(zhuǎn)接在適宜的新鮮培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。3. 標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇、復(fù)壯及標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的制備3.1物品及試劑：接種針、酒精燈、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基:用于黑曲霉復(fù)蘇、復(fù)壯. 用于白色念珠菌復(fù)蘇、復(fù)壯.

7、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基:用于生孢梭菌復(fù)蘇、復(fù)壯.營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:用于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單胞菌復(fù)蘇、復(fù)壯。3.3操作步驟：a.打開潔凈工作臺(tái)。b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并讓其自然風(fēng)干。c.用一小砂輪在安瓿的上部劃一條線，用手輕輕將安瓿掰開（開啟安瓿時(shí)必須小心，因?yàn)榘碴秤鰺釙r(shí)可能會(huì)破裂）。d.以無(wú)菌方法用一無(wú)菌吸管從已準(zhǔn)備好的上述液體培養(yǎng)基中移取0.50.8 ml到安瓿中。e.輕輕地旋轉(zhuǎn)安瓿以使凍干菌種和液體培養(yǎng)基充分混合并完全溶解。f.用無(wú)菌吸管將安瓿內(nèi)菌液全部轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基。g.根據(jù)安瓿上所標(biāo)明的不同菌種類型而將其培

8、養(yǎng)于相應(yīng)的溫度（細(xì)菌培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)1824小時(shí)；真菌培養(yǎng)溫度2328，培養(yǎng)35天。觀察是否渾濁，渾濁說(shuō)明菌種復(fù)蘇生長(zhǎng)；若不渾濁，細(xì)菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天，真菌應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至14天，若仍未渾濁，滅菌處理。h.黑曲霉的菌懸液先室溫待菌懸液融化后用無(wú)菌吸管吸取管內(nèi)液體12滴滴在改良馬丁瓊脂斜面上，用吸管涂布均勻，置2328培養(yǎng)57天，斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應(yīng)有雜色，斜面?zhèn)让鏌o(wú)色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。確認(rèn)后用含有0.05%（ml/ml）的吐溫-80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗脫到無(wú)菌試管中。i.取經(jīng)復(fù)蘇后的上述細(xì)菌菌液8-10ml至液體培養(yǎng)基中按g項(xiàng)操作對(duì)菌種進(jìn)行復(fù)壯。以無(wú)菌

9、技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入100ml20%的無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/管分裝于凍存管。每個(gè)菌種制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。黑曲霉的h項(xiàng)下洗脫液按h項(xiàng)下方法進(jìn)行復(fù)壯，制成復(fù)壯后的孢子懸液20ml。以無(wú)菌技術(shù)向復(fù)壯后的菌種中加入20ml 、30%的無(wú)菌甘油混勻，1-2ml/管封存于凍存管。制備10支，按順序進(jìn)行編號(hào)，最后一支做為質(zhì)控管進(jìn)行質(zhì)量控制，即進(jìn)行相應(yīng)的確認(rèn)。其余作為儲(chǔ)備管。將上述制備好的凍存管逐支粘貼標(biāo)簽。內(nèi)容包括：菌種名稱、菌種代號(hào)、編號(hào)、代次、制備日期、制備人、貯存條件、有效期至等。j儲(chǔ)備菌種管制備成功，儲(chǔ)存于20，有效期

10、為三年。3.4菌種確認(rèn)用無(wú)菌接種環(huán)從質(zhì)控管中取細(xì)菌培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，或相應(yīng)的宜于該細(xì)菌生長(zhǎng)的鑒別平板上，劃線分離出單個(gè)菌落。然后在3035下培養(yǎng)23天；同樣的方法取真菌到玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，并在2328下培養(yǎng)7天；培養(yǎng)后，觀察其菌落形態(tài)，應(yīng)符合該菌種形態(tài)特征。3.5污染處理假如在該平板上發(fā)現(xiàn)有其他菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明或操作有污染或菌種不純。將此被污染了的培養(yǎng)物滅菌處理?？蓪ふ以蛑匦路蛛x挑選純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為第四代。并重新制備儲(chǔ)備菌種管3.6菌種的傳代與保藏將菌種接種至一新鮮培養(yǎng)基上，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當(dāng)原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)，即認(rèn)為已傳代一次，從菌種保

11、藏中心獲得的冷凍干燥的菌種為第0代，冷凍干燥的原始菌種開啟后轉(zhuǎn)種后為第1代，直到第3代為工作菌種。菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過(guò)5代。菌種的傳代保藏過(guò)程3.3項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)菌的復(fù)蘇為傳第一代，復(fù)壯為第二代。傳第三代時(shí)取1支凍存管自然解凍，將其轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時(shí)，工作用菌種為第3代。工作用菌種，分為兩類：一類用于定期傳代(w3)，一類用于實(shí)驗(yàn)用（s3）。定期傳代用菌的傳代其操作步驟如下（斜面接種法）：（1）從冰箱冷藏室中取出菌種斜面后，應(yīng)在室溫放置約30分鐘。（2）將裝有新鮮配制的培養(yǎng)基菌種保藏管管壁上注明菌名及接種日期，和傳代菌種一并移入潔凈工作臺(tái)，打開紫外燈照射一小時(shí)。

12、（3）關(guān)閉紫外燈。點(diǎn)燃酒精燈，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過(guò)三次。（4）右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒并將菌種管口移至火焰上方。（5）塞上管塞，左手將菌種管放下，取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（或改良馬丁瓊脂斜面）一支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部向上劃一條直線，然后從底部向上作連續(xù)曲線劃線，一直劃到斜面頂端，使細(xì)菌接種在斜面的表面上。（6）取出接種環(huán)，在火

13、焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。（7）將已接種好的細(xì)菌管置3035細(xì)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)22 24h，真菌管置2328真菌培養(yǎng)箱最多培養(yǎng)7天。當(dāng)工作用菌種傳代代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如：（w3）可直接轉(zhuǎn)接為（w4）。按上述程序操作，直至（w4）轉(zhuǎn)為（w5）為止，需重新接種，舊的工作菌種進(jìn)行銷毀。菌種斜面的培養(yǎng)、保藏條件及時(shí)間菌種培養(yǎng)條件及時(shí)間培養(yǎng)基保存條件及時(shí)間大腸埃希菌(cmcc(b)44102) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月金黃色葡萄球菌(cmcc(b)26003) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培

14、養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月枯草芽孢桿菌(cmcc(b)63501) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月銅綠假單胞菌(cmcc(b)10104) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月乙型副傷寒沙門菌(cmcc(b)50094) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月生孢梭菌(cmcc(b)64941) 303522 24h 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月白色念珠菌(cmcc(f)98001) 2328最多7天改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月黑曲霉(cmcc(f)98003) 2328最多7天改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基 2 8 保存3個(gè)月短小芽孢