農桿菌介導甜菜遺傳轉化技術規(guī)程

1、ICS65.020.20B 05DB15內蒙古自治區(qū)地方標準DB 15/ TXXXX農桿菌介導甜菜遺傳轉化技術規(guī)程Technical Regulation for Agrobacterium-mediated Sugarbeet Genetic Transformation點擊此處添加與國際標準一致性程度的標識XXXX - XX - XX發(fā)布XXXX - XX - XX實施內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB15/ TXXXX前言本標準按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院提出。本標準由內蒙古自治區(qū)農業(yè)標準化技術委員會(SAM/TC 20)歸口。本標準起草

2、單位：內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院。本標準主要起草人：張自強、白晨、李曉東、張惠忠、王良、韓平安、張必周、付增娟、趙尚敏、鄂圓圓、鄭文哲、張輝。5農桿菌介導甜菜遺傳轉化技術規(guī)程1 范圍本標準規(guī)定了農桿菌介導甜菜遺傳轉化的相關技術要求。本標準適用于農桿菌介導甜菜遺傳轉化的全過程。2 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2.1種球 bulb甜菜通過雜交形成的種子。2.2遺傳轉化genetic transformation此處指異源的質粒被人工感受態(tài)細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉移過程。2.3侵染infection農桿菌進入并感染甜菜外植體的過程。2.4葉片-葉柄leaf-petiole甜菜無

3、菌苗葉片和葉柄相連接的部位，長約 1 cm。3 培養(yǎng)基配置3.1 瓊脂粉培養(yǎng)基用于甜菜種球的萌發(fā)。具體成分為（1 L）：瓊脂粉7.5 g。3.2 誘導分化培養(yǎng)基用于甜菜無菌苗誘導分化培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.75 g，蔗糖30 g，NAA（萘乙酸）0.7 mg，KT（激動素）1.2 mg，瓊脂粉7 g。3.3 繼代培養(yǎng)基用于甜菜無菌苗的繼代培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.75 g，蔗糖30 g，NAA 0.5 mg，KT 0.4 mg，瓊脂粉7.5 g。3.4 生根培養(yǎng)基用于甜菜無菌苗的生根培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.75 g，蔗糖30 g，NAA 1.

4、2 mg，瓊脂粉7.5 g。3.5 YEP培養(yǎng)基用于農桿菌的增值培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：牛肉浸膏5 g，酵母提取物10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15 g，rif（利福平）50 mg，kan（卡娜霉素）50 mg，pH=7.0。3.6 侵染液培養(yǎng)基用于加入農桿菌菌液配制侵染液。具體成分為（1 L）：MS 培養(yǎng)基 4.74 g，蔗糖 30 g，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，AS(乙酰丁香酮)150 M，pH=6.8。3.7 預培養(yǎng)培養(yǎng)基用于甜菜葉片-葉柄的預培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.74 g，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，

5、pH=5.8。3.8 共培養(yǎng)培養(yǎng)基用于侵染后甜菜葉片-葉柄與農桿菌的共培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.74 g，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，AS 150 M，NAA 0.7 mg，KT 1.2 mg，pH=5.8。3.9 脫菌培養(yǎng)基用于共培養(yǎng)后的脫菌。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基 4.74 g，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，rif 500 mg，kan 50 mg，pH=5.8。3.10 篩選培養(yǎng)基用于甜菜轉化后的篩選培養(yǎng)。具體成分為（1 L）：MS培養(yǎng)基4.74 g，蔗糖30 g，瓊脂粉7.5 g，草甘膦0.08 M，pH=5.8。4 滅菌與萌發(fā)4.1 滅菌前準備配制75

6、 %酒精，配制0.1 %升汞，制備滅菌水。4.2 種球滅菌將磨掉花萼完整的甜菜種球，用百菌清（煙劑型）密閉熏蒸24 h后，在超凈工作臺中移至滅過菌的三角瓶中，隨后用75 %酒精消毒2 min，滅菌水漂洗3 次，接著用0.1 %的升汞處理20 min，滅菌水漂洗3 次，最后將消毒后的種子接種于瓊脂粉培養(yǎng)基上。4.3 種球萌發(fā)置于組培室培養(yǎng)，23 條件下進行培養(yǎng)，7 d10 d即可萌發(fā)。待芽長2.0 cm2.5 cm左右時，帶子葉一起切下，接種到新的繼代培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。培養(yǎng)20 d25 d成苗。5 無菌苗培養(yǎng)5.1 誘導分化培養(yǎng)在超凈工作

7、臺上，將無菌苗置于無菌培養(yǎng)皿中，用滅菌后的手術刀將無菌苗的葉片-葉柄切下，長度為0.8 cm1.2 cm的小段，隨后將葉片-葉柄接種于誘導分化培養(yǎng)基中進行分化誘導培養(yǎng)。切去葉片-葉柄的無菌苗去除老化部分接種于繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，供以后切去葉片-葉柄使用。葉片-葉柄和無菌苗培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，光照強度3000 Lux，光照時長為14 h。5.2 繼代培養(yǎng)當誘導的叢生芽長到1 cm2 cm，在超凈工作臺中將叢生芽分切為單苗，接種于培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：溫度 23 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。6 侵染液制備與葉片-葉柄預培養(yǎng)6.1 菌液活化超低溫冰箱中取出冷凍含有目的

8、基因的農桿菌EHA105 C58（rif R）Ti pEHA105（pTiBo542DT-DNA）（strep R）Succinamopne）菌液，將菌液在YEP培養(yǎng)平板中劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ，培養(yǎng)時間14 h。6.2 制備侵染液將培養(yǎng)好的農桿菌刮下來，放置侵染液培養(yǎng)基中重新懸浮，使其OD600值在0.300.50之間，然后冰浴1 h，備用。6.3 葉片-葉柄預培養(yǎng)把從甜菜無菌苗上切下的葉片-葉柄，放在預培養(yǎng)培養(yǎng)基上進行預培養(yǎng)，預培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。預培養(yǎng)時間2 d6 d。7 遺傳轉化7.1 葉片-葉柄預處理預培養(yǎng)后的葉片-葉柄，沿其莖走向用手

9、術刀劃出傷口，傷口的深度以不切透葉片-葉柄為準。7.2 農桿菌侵染將預處理后的葉片-葉柄放入侵染液中，使用真空泵抽真空，使葉片-葉柄完全浸入侵染液，侵染20 min30 min。7.3 共培養(yǎng)從侵染液中取出葉片-葉柄，置于無菌濾紙上吸干表面殘留的侵染液，放入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行共培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：溫度23 ，暗培養(yǎng)。培養(yǎng)時間3 d6 d。7.4 脫菌培養(yǎng)共培養(yǎng)后，將葉片-葉柄放入脫菌培養(yǎng)基中，進行脫菌。培養(yǎng)環(huán)境：搖床轉速125 rpm，溫度25 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。脫菌2 d3 d。7.5 篩選培養(yǎng)脫菌培養(yǎng)后，從脫菌培養(yǎng)基中取出葉片-葉柄，放入篩選培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室培

10、養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：溫度25 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。培養(yǎng)15 d20 d，從部分葉片-葉柄上可長出小芽，進一步培養(yǎng)成轉基因甜菜無菌苗。8 生根培養(yǎng)從篩選培養(yǎng)基中取出成苗，將生長健壯的叢生芽塊切成1 cm2 cm的單芽，接種到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境：溫度25 ，光照強度3000 Lux，光照時間14 h。20 d30 d即可誘導出新生根。9 移栽9.1 煉苗去掉封口膜，在組培室鍛煉2 d3 d。9.2 室內移栽選擇根系生長健壯的無菌苗，用自來水浸泡根部培養(yǎng)基12 h，然后取出無菌苗洗凈根部殘留培養(yǎng)基，移栽到花盆中并用燒杯扣住，定期澆水，室內培養(yǎng)7 d14 d，移去燒杯。9.3 大田移栽待盆栽幼苗生長健壯，平均氣溫穩(wěn)定在