嗜肝病毒大衣殼蛋白雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)決定因子.doc

-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-原文：Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins作者：CarstenLambert,SylviaMannandReinhildPrange作者單位：DepartmentofMedicalMicrobiologyandHygiene,UniversityofMainz,Augustusplatz,D-55101Mainz,Germany發(fā)表刊物：JournalofGeneralVirology(2004),85,12211225DOI10.1099/vir.0.19737-0以下為中文翻譯稿：嗜肝病毒大衣殼蛋白雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)決定因子摘要：為實(shí)現(xiàn)功能多樣性，乙型肝炎病毒通過S結(jié)構(gòu)域翻譯過程中的膜整合和部分pre-S亞結(jié)構(gòu)域翻譯后的轉(zhuǎn)移獲得了雙重跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。因?yàn)槊總€(gè)過程都需要第二個(gè)跨膜區(qū)域（thesecondtransmembranesegment，TM2)，我們利用蛋白保護(hù)實(shí)驗(yàn)對(duì)L蛋白突變體進(jìn)行分析，探討該決定因子的行為。我們發(fā)現(xiàn)，亮氨酸拉鏈基序和TM2側(cè)翼電荷均不影響L的拓?fù)鋵W(xué)再定位。表型混合試驗(yàn)則表明在指引正確的L蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)方面鴨HBVL蛋白的preS和S蛋白結(jié)構(gòu)域不能代替HBV上的相應(yīng)元件行使功能，因而兩個(gè)嗜肝病毒屬具有不同的轉(zhuǎn)移機(jī)制。由于基因組較小，病毒都是利用盡可能小的多肽序列儲(chǔ)存盡可能多的信息。因此，很多由病毒編碼的蛋白和蛋白結(jié)構(gòu)域都具有多種功能。乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）（嗜肝病毒科Hepadnaviridae代表種），的大衣殼蛋白（L）即是其中的一個(gè)例子。該蛋白在病毒進(jìn)入時(shí)作為受體蛋白起作用；在病毒組裝時(shí)，則是基質(zhì)類似蛋白，同時(shí)還行使調(diào)節(jié)功能（Brussetal.，1996）。這種多功能性依賴于雙重膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。該現(xiàn)象首先在嗜肝病毒L糖蛋白中被觀察到(Brussetal.,1994；Ostapchuketal.,1994；Prange&Streeck,1995；Guo&Pugh,1997；Swameye&Schaller,1997)。最近，越來越多的證據(jù)表明，其他一些病毒衣殼蛋白也存在有兩種或更多種拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)行使多種不同的功能,如：豬傳染性胃腸炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGE）的膜蛋白（Escorsetal.，2001）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）E1和E2衣殼蛋白亞結(jié)構(gòu)域（Cocquereletal.,2002）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）融合蛋白(McGinnesetal.,2003)等。到目前為止，對(duì)于HBVL蛋白雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的形成機(jī)制仍然了解不多。L蛋白、中（M）和?。⊿）衣殼蛋白由一個(gè)開放閱讀框從不同位點(diǎn)起始翻譯表達(dá)而來。因此，S蛋白序列在含preS2結(jié)構(gòu)域的M蛋白和含preS2和preS1結(jié)構(gòu)域的L蛋白的C端得到重復(fù)（Heermann&Gerlich,1991)。這三個(gè)蛋白都在翻譯過程中整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreticulum，ER）膜上，該過程很可能由第一和第二個(gè)跨膜(transmembrane，TM)節(jié)段（TM1和TM2）上的信號(hào)錨定和轉(zhuǎn)移停止序列所向?qū)?Ebleetal.,1987)。這些信號(hào)也將M蛋白preS2上游區(qū)域在翻譯時(shí)導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(Ebleetal.,1990)。與此相反，L蛋白preS2和preS1（preS）結(jié)構(gòu)域開始時(shí)-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-都停留在細(xì)胞質(zhì)中。成熟過程中，大約一半的L蛋白將preS結(jié)構(gòu)域翻譯后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而產(chǎn)生病毒衣殼內(nèi)的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(Brussetal.,1994)(Fig.1)。通過將preS結(jié)構(gòu)域定位于胞質(zhì)（病毒內(nèi)）和管腔（病毒外），L蛋白在病毒生活周期中行使兩種截然不同的功能：病毒衣殼和結(jié)合受體。我們以前的研究表明：在病毒組裝過程中，部分HBVpreS的翻譯后轉(zhuǎn)移似乎并不通過由衣殼蛋白跨膜區(qū)橫向相互作用所產(chǎn)生的特異性通道，因?yàn)樵撨^程既不需要S和M蛋白，也不需要任何參與通道形成的雙性跨膜區(qū)域（Lambert&Prange,2001）。更確切地說L蛋白拓?fù)鋵W(xué)再定位與宿主細(xì)胞跨膜運(yùn)輸機(jī)制有關(guān)，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)它與ER膜相關(guān)。這些研究同時(shí)表明：TM2是preS翻譯后轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵決定因子。第二決定因子則指向L蛋白preS1結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域。Fig.1.HBVL衣殼蛋白結(jié)構(gòu)域和跨膜拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。(A)L蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖。數(shù)字代表氨基酸位置；白框代表四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，前兩個(gè)分別為1和2；代表Asn-309上的N-連接糖基化。(B)L在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的拓?fù)鋵W(xué)模型。開始隨著翻譯過程中的膜整合，pre-S位于ER的胞質(zhì)面（左）；成熟過程中，約50%L蛋白的pre-S在翻譯后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（右）。(C)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞表達(dá)的HA-taggedL蛋白的胰蛋白酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)分析。轉(zhuǎn)染兩天后，準(zhǔn)備微粒體，進(jìn)行胰蛋白酶和NP-40存在與否的交叉處理，樣品通過HA特異性免疫印跡進(jìn)行檢測(cè)分析。L蛋白的糖基化(gp42)和非糖基化(p39)形式以及胰蛋白酶處理后的非糖基化(T)和單糖基化(gT)片段圖中都有標(biāo)示。此實(shí)驗(yàn)中，S和M蛋白的合成通過起始密碼子的錯(cuò)義突變被抑制。該結(jié)構(gòu)域被稱為胞質(zhì)錨定因子（cytosolicanchoragedeterminant，CAD），它能與同源熱休克蛋白（heat-shockprotein，Hsc70）相互作用，而阻止翻譯過程中preS的轉(zhuǎn)移(Lffler-Maryetal.,1997；Lambert&Prange,2003)。兩個(gè)拓?fù)鋵W(xué)決定子都在相同的L分子中發(fā)揮順式作用。這與DHBVL同源物不同。DHBVL同源物采用相同的雙重拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，但限制pre-S特異決定子，如一系列賴氨酸殘基和Hsc70結(jié)合因子，作為順式元件起作用，；而共表達(dá)S鏈所提供的S-特異決定子,如TM1,則是作為反式因子起作用(Swameye&Schaller,1997；Grgacic,2002)。兩者更大的差異還在于DHBVL蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換與衣殼形態(tài)發(fā)生和輸出相一致(Grgacic,2002)?？傊?，這些現(xiàn)象都說明這兩種嗜肝病毒L蛋白雖具有相同的表型，但其折疊方式卻背道而馳。本文將集中關(guān)注HBVL蛋白重定位過程中的拓?fù)鋵W(xué)決定子以及它們的分子特性、功能和對(duì)蛋白定向的影響。我們構(gòu)建了一系列蛋白突變體并通過COS7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)對(duì)其拓?fù)鋵W(xué)特征進(jìn)行分析。另外，微粒體的胰蛋白酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)也被用于檢測(cè)部分L蛋白pre-S翻譯后的跨膜分布(Lambert&Prange,2001)。當(dāng)L蛋白在PNI2.LHA質(zhì)粒中，以HA-tag融合進(jìn)行表達(dá)時(shí)，該蛋白將以成對(duì)形式出現(xiàn)：39kDa的非糖基化蛋白(p39)和42kDa單糖基化蛋白(gp42)（S結(jié)構(gòu)域Asn309被部分N-糖基化的結(jié)果）。新合成的L蛋白的preS區(qū)域?qū)σ鹊鞍酌傅那懈罘浅Ｃ舾?。但隨著時(shí)間遷移，部分L蛋白翻譯后轉(zhuǎn)移至ER，而對(duì)胰蛋白酶的切割產(chǎn)生保護(hù)，有達(dá)5060%的L蛋白對(duì)胰-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-蛋白酶有抗性而處于穩(wěn)定狀態(tài)（Fig.1）。因此，去污劑（NP40）不存在時(shí)，胰蛋白酶的處理將L蛋白分成兩部分：一部分L蛋白的preS翻譯后定位于ER，對(duì)胰蛋白酶具抗性，而以全長(zhǎng)分子形式存在；另一部分L蛋白preS轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)，對(duì)胰白酶敏感，從而被切割為非糖基化的25kDa片段（T）和對(duì)應(yīng)于C端S區(qū)域，被單糖基化的28kDa片段（gT）。當(dāng)微粒體用NP40崩解后，L蛋白都被切割成T和gT兩個(gè)片段。preS蛋白的翻譯后再定位模式已被含兩個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性糖基化位點(diǎn)(Asn4和Asn123)的preS不能被N-連接糖基化的事實(shí)所證實(shí)（LfflerMaryetal.,1997）。我們以前的研究表明，在L蛋白的四個(gè)跨膜區(qū)域中，只有TM2是preS翻譯后轉(zhuǎn)移所需要的（Lambert&Prange,2001）。盡管這些結(jié)果很大程度上排除了HBV特殊衣殼結(jié)構(gòu)作為preS通道的可能性，但仍有可能TM2結(jié)構(gòu)域通過helicalpacking的橫向相互作用形成自主轉(zhuǎn)移通道。由此通過數(shù)據(jù)分析，我們?cè)赥M2中找到了一個(gè)可能具自身相互作用并能形成孔道結(jié)構(gòu)的亮氨酸富含區(qū)(Gurezkaetal.,1999；Scholzeetal.,2002)。為了確認(rèn)這個(gè)由Leu247,Leu254和Leu261組成的亮氨酸拉鏈基序是否與PreS重新定位有關(guān)，我們通過PCR方法構(gòu)建了一些雙重或三重丙氨酸替代突變體。L247/254A、L247/261A、L254/261和L247/254/261A突變體在COS7細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其產(chǎn)物和野生型L蛋白一樣均成對(duì)出現(xiàn)，并在翻譯過程中插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(Fig.2A)。拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析顯示所有雙重突變體都具野生型的轉(zhuǎn)移特征在沒有NP40時(shí)，4050%的多肽受微粒體膜的保護(hù)而不被胰蛋白酶切割。三重突變體使preS在更大程度上表現(xiàn)出翻譯后轉(zhuǎn)移特性。因此，亮氨酸拉鏈基序不為preS翻譯后轉(zhuǎn)移所需，但似乎影響其程度。Fig.2.TM2在L蛋白pre-S翻譯后轉(zhuǎn)移過程中的作用。(A)亮氨酸拉鏈基序不為pre-S的翻譯后轉(zhuǎn)移所依賴。左圖中亮氨酸拉鏈基序的氨基酸被展示，亮氨酸用黑體標(biāo)示，數(shù)字表示亮氨酸的氨基酸位置；右圖為HA融合的L突變體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后的胰蛋白酶切割實(shí)驗(yàn)分析。L蛋白非糖基形式(p39)和單糖基化形式(gp42)的位置如圖。(B)TM2側(cè)翼極性氨基酸不為pre-S的翻譯后轉(zhuǎn)移所依賴。在左圖，TM2側(cè)翼極性氨基酸R-236,R-241,R-242andD-262用黑體所標(biāo)示；右圖表示突變體的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析（胰蛋白酶切割試驗(yàn)）。突變體以替代氨基酸命名。p39和gp42已被表示。TM2的另一顯著特點(diǎn)是鄰近電荷的不對(duì)稱分布，包括前面的三個(gè)精氨酸和后面緊接的一個(gè)天冬氨酸。根據(jù)對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域兩側(cè)極性殘基功能的了解（Boyd&Beckwith,1990），這些電荷似乎對(duì)TM2的停止轉(zhuǎn)移功能很重要，另外它們的極性側(cè)鏈可能參與螺旋間氫鍵以及跨膜螺旋相互作用（VbarretxenaBelandia&Engelman,2001）在L鏈間形成蛋白與蛋白接合界面，使preS在翻譯后轉(zhuǎn)移。我-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-們將Arg236，Arg241，Arg242和Asp262依次突變成不帶電殘基，如：丙氨酸和亮氨酸，以檢驗(yàn)它們對(duì)L重折疊的影響。蛋白保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示R236L，R242A和D262A突變體均能形成正確的L拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為在完整微粒體中對(duì)胰蛋白酶切割有部分抗性，缺乏preS耦聯(lián)的N-聚糖(Fig.2B)，而R241A突變體能更高水平地在翻譯后轉(zhuǎn)移preS。也許這種替代會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)上更大程度地失去對(duì)轉(zhuǎn)移的控制，從而改變定位于管腔內(nèi)的preS與定位于細(xì)胞質(zhì)的preS間的平衡。綜合這些數(shù)據(jù)表明L蛋白翻譯后的重新定位不依賴TM2上可能的跨膜helixhelixpacking基序、亮氨酸拉鏈基序、極性氨基酸，進(jìn)而揭示L重折疊與衣殼組裝無關(guān)。Fig.3.DHBV衣殼蛋白亞基不能功能性取代HBVpre-SandS結(jié)構(gòu)域。(A,B)preS(h):S(d)andpreS(d):S(h)嵌合體示意圖。(A)preS(h):S(d)：HBVpre-S結(jié)構(gòu)域與DHBVS結(jié)構(gòu)域融合；(B)preS(d):S(h)：DHBVpre-S結(jié)構(gòu)域與HBVS結(jié)構(gòu)域融合.圖中數(shù)字代表氨基酸的位置。為分析N-連接低聚糖，細(xì)胞裂解物分為兩部分：一部分不處理(lane1)，另一部分用PNGaseF消化(lane2)。拓?fù)鋵W(xué)分析則繼續(xù)采用胰蛋白酶消化試驗(yàn)。蛋白通過SDS-PAGE和HA-特異性免疫印跡進(jìn)行分析。非糖基化(p)和糖基化(gp,ggp)形式產(chǎn)物用箭頭標(biāo)示。右邊的數(shù)字代表標(biāo)準(zhǔn)分子量（kDa）。為了更深入的了解L蛋白的拓?fù)鋵W(xué)行為，我們進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域交換實(shí)驗(yàn)對(duì)哺乳類和禽類HBV衣殼蛋白亞結(jié)構(gòu)域進(jìn)行洗牌。首先我們用DHBVS區(qū)域取代HBVL蛋白S區(qū)域，構(gòu)建preS(h):S(d)嵌合體（DHBVS區(qū)域擴(kuò)增自質(zhì)粒pDHBVWildneretal.,1991)。與預(yù)期的一致，preS(h):S(h)表達(dá)形成37KDa的膜結(jié)合蛋白(Fig.3A)。令人驚訝的是，另外還有兩個(gè)高分子量蛋白。在用N-glycosidaseF（PNGaseF）去糖基化后這些條帶消失，表明它們被N-連接糖基化。因?yàn)镈HBVS結(jié)構(gòu)域不含N-聚糖，pres(h):S(d)的修飾只可能發(fā)生在pre-S的Asn4和Asn-123。又因preS(h):S(d)的這些糖基化