原子力顯微鏡在納米生物學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-原子力顯微鏡在納米生物學(xué)研究中的應(yīng)用蔣青青1張利娟2張鈺1郭彥1任煒1張曉暉1王鑫艷1(1中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所,上海200031,2重慶市畜牧科學(xué)院,重慶402460)摘要原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope,AFM)自從1986年發(fā)明以來，作為一種重要的單分子研究工具，在包括細胞粘附、蛋白折疊以及蛋白間的相互作用等生物學(xué)過程的研究中得到了廣泛應(yīng)用。本文主要介紹原子力顯微鏡的原理，著重于研究相互作用時能壘大小的確定，以及常用的單分子表面修飾方法。關(guān)鍵詞原子力顯微鏡(AFM)；單分子；能壘；表面修飾1引言蛋白之間正常的相互作用是機體發(fā)揮其生理學(xué)功能的基礎(chǔ)。目前的生化方法可以檢測出蛋白間相互作用的親和力或速度常數(shù)。盡管這些方法可以估測出蛋白相互作用的速率和自由能的指標，但是它們不能檢測相互作用動力學(xué)的重要特征，而那些恰恰可以揭示各種不同的中間態(tài)或替代反應(yīng)途徑。近幾十年，很多可以直接用于測量生物分子間相互作用這一動態(tài)過程的高分辨率的技術(shù)迅速發(fā)展，包括原子力顯微鏡、光鑷和生物膜力學(xué)探針等單分子技術(shù)。其中，原子力顯微鏡擁有低至納米和微秒水平的超高分辨率，為實時測量單分子間的相互作用提供了新的途徑1,2。采用單分子技術(shù)避免了其他方法的內(nèi)在缺陷，使實時檢測單個分子間的相互作用成為可能1,3,4。因此單分子技術(shù)無疑成了理解控制蛋白間結(jié)合、解離和過渡態(tài)能級圖的有力工具2,5。此外，在細胞表面，外力作用可以不斷的拉伸分子。比如細胞遷移時，利用單分子技術(shù)，可以觀察在牽引力誘導(dǎo)下細胞表面粘附受體受到粘附和去粘附的循環(huán)過程6。而傳統(tǒng)的生物技術(shù)要揭示蛋白間相互作用的內(nèi)力和外力的影響往往難以實現(xiàn)7。但是，采用原子力顯微鏡之類的單分子工具，則可以直接測出保持蛋白復(fù)合體的力，并可測量反應(yīng)過程中的壓力和拉力2，有助于深入研究細胞表面收稿日期:2010-01-05接受日期:2010-8-31中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目百人計劃(No.0813S11411)資助項目通訊作者。TelFaxE-mail:-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-及蛋白間相互作用的動力學(xué)能級和確定能壘。本文就原子力顯微鏡的原理、方法及其作為單分子工具在蛋白間相互作用研究中的應(yīng)用做一簡要綜述，著重闡述研究相互作用時能壘大小的確定，以及常用的單分子表面修飾方法。2原子力顯微鏡簡介2.1原子力顯微鏡工作原理原子力顯微鏡主要包括微懸臂、探針、樣品臺、能精確移動樣品臺或微懸臂的壓電陶瓷轉(zhuǎn)換器、以及用于記錄微懸臂反射光偏移變化的包含了激光和光電探測器的光學(xué)偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)(圖1)。微懸臂的尖部置于倒置顯微鏡上，實時采集光學(xué)和原子力顯微鏡信號，從而能夠?qū)崟r觀察到細胞形態(tài)，更適宜對活細胞進行研究。原子力顯微鏡最早被用作成像工具4，通過有彈性的微懸臂掃描來探測樣品的形貌。在成像模式下，原子力顯微鏡是通過在X和Y軸方向，掃描連在其懸臂末端的探針在接觸樣品時實現(xiàn)的。在做樣品表面掃描時，壓電陶瓷不斷的校正微懸臂的位置從而保持偏離常數(shù)不變，通過探測探針的位置變化，可以轉(zhuǎn)化得到原子級分辨率的樣品表面形貌圖。為了把偏離轉(zhuǎn)換為力單位，微懸臂必須經(jīng)過校準測量，然后算出微懸臂的彈性系數(shù)kC。校準微懸臂的方法有2種8：應(yīng)用已知的力常數(shù)F測出微懸臂的偏離x9，或者測量微懸臂的熱共振頻率10。目前最常用的方法是根據(jù)Hutter和Bechhoefer的方法10，把微懸臂看做一個簡易的諧振器，振動模式下每接收到一個自由度的熱能kBT/2，微懸臂即可從已測量過的微懸臂偏離方差來計算其彈性系數(shù)，即1/2kBT=1/2kC，其中kB和T分別代表波爾茲曼常數(shù)和絕對溫度。-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-Fig.1Schematicoftheatomicforcemicroscope(AFM)一束激光直接打在微懸臂上，繼而反射到裂像光電二極管上面，通過不同的A-B信號就反映出施加給探針的力。微懸臂小位移時遵從胡克定律，所以微懸臂彈性系數(shù)校正后的光電二極管信號即反映了探針和樣品間的相互作用力。2.2典型的原子力顯微鏡力曲線采用力掃描模式，原子力顯微鏡可以在單分子水平測定兩個相對獨立表面間的相互作用，出現(xiàn)就是典型的原子力顯微鏡力曲線。當(dāng)微懸臂上抬時，通過測量相對于“零點力”的偏移量，得到懸臂接觸表面后返回的曲線，從而得到單個蛋白復(fù)合體間分開的力(圖2)。在很多實驗中，微懸臂的移動速度達到每秒幾個微米時，力的曲線通過測定微懸臂速度就可得到。由于介質(zhì)中存在阻力，微懸臂在自由接近和向后拉時將經(jīng)受一個與速率成比例的彎曲常數(shù)。阻力不僅取決于微懸臂的速率和隨溫度變化的介質(zhì)的粘性，還取決于微懸臂的自身特點、樣品的形貌、以及微懸臂與樣品的接觸和分開過程11。采用原子力顯微鏡的力掃描模式，Lee12和Florin13直接測出了單個親和素和生物素解開的力。盡管這種方法1994年才第一次報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種蛋白間相互作用的研究采用了這種或者類似的方法。在研究抗生物素蛋白鏈菌素(streptavidin)與生物素(biotin)的相互作用時，所檢測出的是典型的力曲線：測量開始后，壓力首先增大，然后移動瓊脂糖小球逐漸接近微懸臂。小球和微懸臂接觸前，偏離/力信號保持在穩(wěn)定基線對應(yīng)的零點力處。小球與微懸臂接觸后，微懸臂就向上彎曲，導(dǎo)致偏離/力信號發(fā)生正向變化。當(dāng)達到了預(yù)設(shè)的力時(本例中是200pN)，壓力就停止增加?？股锼氐鞍祖溇睾蜕锼卦陬A(yù)設(shè)的接觸時間內(nèi)彼此接觸。當(dāng)壓力開始回縮，并逐漸移動小球回到它最初的位置時，微懸臂向下偏轉(zhuǎn)，從而揭示了這段時間內(nèi)的粘附接觸過程。小球繼續(xù)回縮，作用于抗生物素蛋白鏈菌素和生物素的電壓逐漸增加，直到最后鏈斷裂，通過在回縮軌跡上陡的垂直躍遷即可看出。最后，微懸臂退回到最初零力的靜止位置。-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-Fig.2ArepresentativeunbindingtraceArepresentativeatomicforcemicroscope(AFM)forcescan(i.e.,opticalsignalvs.piezodisplacement)underforcescanmode.ThetwointeractingsurfacesaretheAFMtipfunctionalizedwithstreptavidinandanagarosebeadwithimmobilizedbiotin.2.3探針與基底的表面修飾在研究蛋白-蛋白相互作用的時候，蛋白或者配體被固定在原子力顯微鏡微懸臂的探針上，相互作用的受體被連接在一個合適的表面。當(dāng)兩個表面相互接觸，探針離開表面時分子的相互作用力被懸臂的形變反映出來。因此合適的探針和樣品處理對于這類研究的成功是非常重要的。修飾探針的方法通常包括物理吸附和使用帶有特殊基團交聯(lián)分子的共價連接，修飾基底與修飾探針的方法相似物理吸附或共價連接，云母、聚苯乙烯、玻璃以及鍍金的