基因工程及其應(yīng)用課件(上課)ppt課件

.,最新款的摩托車,你想過嗎?,.,誰能告訴我這是？,.,誰能告訴我這是？,.,香蕉魚,你見過嗎?,.,你知道什么是真正的碩果累累嗎?,.,給科學(xué)插上想象的翅膀，你會收獲更多！,.,一、基因工程與基因,基因決定性狀,家蠶能夠吐出蠶絲為人類利用,豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮,青霉菌能產(chǎn)生對人類有用的抗生素青霉素,.,.,二、基因的認(rèn)識,.,1866年發(fā)表論文，提出分離規(guī)律和獨(dú)立分配規(guī)律。1900年Mendel遺傳規(guī)律被重新發(fā)現(xiàn)，遺傳學(xué)的元年,1866年，孟德爾（JohannGregorMendel，18221884）提出了遺傳因子（hereditaryfactor）的概念。他將控制豌豆性狀的遺傳因素稱之為遺傳因子形成了基因的雛形。,（1856-1864豌豆雜交實驗）,1、基因的發(fā)展過程,.,1909年，丹麥的遺傳學(xué)家WilhelmLudwigJohanssen(1859-1927)。根據(jù)希臘語“給予生命”之義，創(chuàng)造了“gene”一詞，并用這個術(shù)語代替孟德爾的“遺傳因子”。不過他所說的基因并不代表物質(zhì)實體，而是一種與細(xì)胞的任何可見形態(tài)結(jié)構(gòu)毫無關(guān)系的抽象單位。因此，那時所指的基因只是遺傳性狀的符號，還沒有具體涉及基因的物質(zhì)概念。,.,“遺傳因子/基因”的設(shè)想一經(jīng)提出，便推動人們?nèi)ふ?，去探索基因在哪里？基因是什么?.,顯微鏡技術(shù)與染色技術(shù)的發(fā)展，使人們注意到，細(xì)胞分裂時，尤其是減數(shù)分裂中，染色體的行為和孟德爾提出的等位基因的分離規(guī)律相當(dāng)一致，所以，確定基因在細(xì)胞核中，在染色體上。,.,第一次將代表某一特定性狀的基因與某一特定的染色體聯(lián)系起來，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論。隨后遺傳學(xué)家又應(yīng)用當(dāng)時發(fā)展的基因作圖（genemapping）技術(shù)，構(gòu)筑了基因的連鎖圖，進(jìn)一步揭示了在染色體載體上基因是按線性順序排列的。,1910年，美國遺傳學(xué)家摩爾根（ThomasHuntMorgan,1866-1945）以果蠅為研究材料，發(fā)現(xiàn)了連鎖交換定律并提出遺傳粒子學(xué)說。,1933,.,發(fā)現(xiàn)DNA的遺傳功能，始于1928年英國科學(xué)家格里菲斯（PGriffith）所做的用肺炎雙球菌感染小鼠的實驗。首次發(fā)現(xiàn)了基因是一類特殊生物分子的證據(jù)。,FredericGriffith18791941,格里菲斯用肺炎球菌做實驗時發(fā)現(xiàn)了一個令人驚異的現(xiàn)象：加熱殺死的能致病的S型菌不能致病的R型菌混合注射到小鼠體內(nèi)小鼠病死從死鼠體內(nèi)分離出大量的S型肺炎球菌難道S型致病菌復(fù)活了嗎？這就是著名的“格里菲斯之謎”。,.,艾弗里等人的實驗說明使細(xì)菌性狀發(fā)生轉(zhuǎn)化的因子是DNA（即脫氧核糖核酸），而不是蛋白質(zhì)或RNA（即核糖核酸）。不僅揭開了“格里菲斯之謎”，并且在世界上第一次證明基因就在DNA上。,OswaldTheodoreAvery(18771955),1944年，艾弗里首次證實遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)是DNA，基因位于DNA上。實驗材料是肺炎鏈球菌，他們發(fā)現(xiàn)死去的S型菌并未復(fù)活，而是S型菌的DNA進(jìn)入了R型菌，使其轉(zhuǎn)化為新的S型致病肺炎雙球菌。,.,美國微生物學(xué)家阿爾弗雷德戴赫爾希（AlfredDayHershey，19081997）他們的實驗材料是T2噬菌體實驗證實，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的噬菌體是核酸；進(jìn)而說明，攜帶遺傳信息的是核酸，而不是蛋白質(zhì)。噬菌體的DNA不但包括噬菌體自我復(fù)制的信息，而且包括合成噬菌體蛋白質(zhì)所需要的全部信息。1952年，赫爾希和他的學(xué)生共同發(fā)表報告，肯定了艾弗里的結(jié)論。此后，再也無人懷疑DNA是遺傳物質(zhì)了。,1969,.,1953年，F(xiàn)rancisCrick和JamesWatson創(chuàng)立DNA雙螺旋模型，證實基因是具有一定遺傳效應(yīng)的DNA片段。用分子結(jié)構(gòu)的特征解釋生命現(xiàn)象最基本問題之一基因復(fù)制的機(jī)理，從而使生物學(xué)真正進(jìn)入分子生物學(xué)的新時代。,1953,.,1961年，美國生物學(xué)家尼倫伯格（MarshallWarrenNirenberg，1927）等人成功破譯了遺傳密碼，以無可辯駁的科學(xué)依據(jù)證實了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的正確性。人們對遺傳機(jī)制有了更深刻的認(rèn)識。,1967年發(fā)表了全套的遺傳密碼表。,1968,.,理論上的三大發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是DNA發(fā)現(xiàn)了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機(jī)理發(fā)現(xiàn)了遺傳信息的傳遞方式,基因工程的準(zhǔn)備階段,.,技術(shù)上的三大發(fā)明：,1967發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶；1970Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)T4噬菌體DNA連接酶；1972建立雙鏈DNA的連接方法。,3.基因工程的載體:Geneticengineeringvector1972,2.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn):Restrictionenzyme1970,1.DNA連接酶的發(fā)現(xiàn):DNAligase1967,獨(dú)立于染色體外的遺傳因子：細(xì)菌的性因子F因子;抗藥性因子（R）;大腸桿菌素因子（COE）,.,基因工程誕生的理論基礎(chǔ):,1.DNA是遺傳物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立3.遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定,1.剪刀:限制性核酸內(nèi)切酶2.針線:DNA連接酶3.運(yùn)輸工具:質(zhì)粒等,基因工程誕生的技術(shù)保障:,.,1973年斯坦福大學(xué)的S.Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。,Sr,PSC101R6-3：質(zhì)粒Ner：抗新霉素基因Sr：抗黃胺基因Tcr：抗四環(huán)素基因,1986Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎,1986,.,StanleyCohen,HerbertBoyer,非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗。,基因工程：即。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，地改造生物的。,原理：,操作水平：,結(jié)果：,一、基因工程,基因重組,DNA分子水平,定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種。,基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù),定向,遺傳性狀,二、基因操作的工具,1、基因工程的,指“限制性核酸內(nèi)切酶”,主要存在于微生物（200種）,一種限切酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并在特定切點切割DNA分子,已發(fā)現(xiàn)的有4000多種,.,大腸桿菌(E.coli)的一種限制性核酸內(nèi)切酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。,限制性核酸內(nèi)切酶,.,切割結(jié)果:產(chǎn)生黏性末端,被限制性核酸內(nèi)切酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。,.,限制性內(nèi)切酶（EcoR）作用過程,.,要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制性核酸內(nèi)切酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個粘性末端？,要切兩個切口，產(chǎn)生四個粘性末端。,如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制性核酸內(nèi)切酶來切割，會怎樣呢？,會產(chǎn)生相同的粘性末端，然后讓兩者的粘性末端粘合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。,.,Sma,平末端平末端,產(chǎn)生平末端:如Sma限制性核酸內(nèi)切酶,切割的化學(xué)鍵：磷酸二酯鍵,.,例：限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列和切點是GGATCC，限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列和切點是GATC。在質(zhì)粒上有酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有1個酶的切點。請畫出質(zhì)粒被限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的粘性末端。請畫出目的基因兩側(cè)被限制性核酸內(nèi)切酶切割后所形成的粘性末端,.,.,下列關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶的說法正確的是（）A.限制性核酸內(nèi)切酶廣泛存在于各種生物中，但微生物中少B.一種限制性核酸內(nèi)切酶只能識別一種特定的核苷酸序列C.不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA后都會形成粘性末端D.限制性核酸內(nèi)切酶的作用部位是特定核苷酸形成的氫鍵,B,.,限制酶是一群核酸切割酶，可辨識并切割DNA分子上特定的核苷酸堿基序列。下圖為四種限制酶BamHI,EcoRI,Hind以及BgI的辨識序列：箭頭表示每一種限制酶的特定切割部位，其中哪兩種限制酶所切割出來的DNA片段末端，可以互補(bǔ)結(jié)合？其正確的末端互補(bǔ)序列為何？（）ABamHI和EcoRI；末端互補(bǔ)序列AATTBBamHI和Hind；末端互補(bǔ)序列GATCCBamHI和BgI；末端互補(bǔ)序列GATCDEcoRI和Hind；末端互補(bǔ)序列AATT,C,2、基因工程的,指“DNA連接酶”,將互補(bǔ)配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子,.,DNA連接酶的作用過程,DNA連接酶的作用位點是：相鄰的兩個脫氧核苷酸的切口。即生成：磷酸二酯鍵。,.,.,DNA連接酶,3、基因的運(yùn)載體,（2）應(yīng)具備條件：,能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制或與染色體、DNA整合后進(jìn)行同步復(fù)制,具有一個或多個限制酶切點，供目的基因插入其中,具有某些標(biāo)記基因，供重組DNA的檢測和鑒定,（3）常用類型：,（1）功能：將目的基因送入受體細(xì)胞,質(zhì)粒、噬菌體和動、植物病毒等,標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測。,其中質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌和酵母菌等生物中,是細(xì)胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子.,.,步驟一：獲取目的基因,目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實施基因工程的第一步。,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，植物的抗病基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,.,從基因文庫中獲取目的基因：,基因文庫:一個生物體的基因組DNA用限制性核酸內(nèi)切酶部分酶切后，將酶切片段插入到載體DNA分子中，所有這些插入了基因組DNA片段的載體分子的集合體，將包含這個生物體的整個基因組，也就是構(gòu)成了這個生物體的基因文庫。(genelibrary).,.,.,1.“鳥槍法”（“散彈射擊法”）用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的所有片段分別在各個受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再利用一定方法將目的基因的DNA片段分離出來。,.,(1)反轉(zhuǎn)錄法：,2.人工合成基因,.,(2)根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：,.,步驟二：制備重組DNA分子（基因表達(dá)載體的構(gòu)建）,（1）用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端。（2）用同一種限制酶切斷帶有目的基因的外源DNA片段，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。,目的基因與載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重新組合的過程。,.,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理,借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑，如土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。,步驟三：轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞（將攜帶目的基因的載體導(dǎo)入受體細(xì)胞）,.,1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)）,.,2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞（顯微注射技術(shù)）,.,3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,大腸桿菌細(xì)胞最常用的轉(zhuǎn)化方法是:（1）用CaCl2處理細(xì)菌，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。（3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非?？?，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。,.,步驟四：篩選出獲得目的基因的重組細(xì)胞,.,步驟五：培養(yǎng)受體細(xì)胞并誘導(dǎo)目的基因的表達(dá),.,重組的DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞后受體細(xì)胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達(dá)過程。,受體細(xì)胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達(dá)嗎？,若不能表達(dá)，要對抗蟲基因再進(jìn)行修飾。,.,.,思考：依照中心法則分析番茄軟化的原因：,.,.,.,熒光蛋白酶基因轉(zhuǎn)化花卉,.,哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？,1、DNA測序儀：2、PCR技術(shù)：,能快速地測定DNA樣品的堿基序列。,在體外通過酶促反應(yīng)有選擇的大量擴(kuò)增目的基因或序列的技術(shù)。,.,概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是一項在體外通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增目的基因或序列的技術(shù)。,條件：目的基因或序列、四種脫氧核苷酸、DNA聚合酶、一對引物(做啟動子),原理：DNA復(fù)制,方式：以指數(shù)方式擴(kuò)增。,結(jié)果：,使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,.,90-95變性,50-65退火,70-75延伸,PCR反應(yīng)過程：,20-40個PCR循環(huán),1個PCR循環(huán),.,.,過程：,a、DNA變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_斷裂，形成_,b、退火（復(fù)性50-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,.,四、基因工程的應(yīng)用,1、基因工程與作物育種,.,.,（AntifreezeProteinsAFPs),避免細(xì)胞結(jié)冰有助植物抗凍,抗凍糖蛋白,無冰晶細(xì)菌幫助草莓抗霜凍,降低原生質(zhì)冰點,抑制冰晶重結(jié)晶,修飾冰晶形態(tài),調(diào)節(jié)原生質(zhì)膠體性質(zhì),.,抗蟲轉(zhuǎn)基因植物,.,生長快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國),乳汁中含有人生長激素的轉(zhuǎn)基因牛(阿根廷),.,轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒,.,2、基因工程與藥物研制,我國生產(chǎn)的部分基因工程疫苗和藥物,許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。,微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。,.,胰島素從豬、牛等動物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰島素，其產(chǎn)量之低和價格之高可想而知。,將合成的胰島素基因?qū)氪竽c桿菌，每2000L培養(yǎng)液就能產(chǎn)生100g胰島素！使其價格降低了30%-50%!,.,基因工程做成的“超級細(xì)菌”能吞食和分解多種污染環(huán)境的物質(zhì)。,通常一種假單孢桿菌只能分解石油中的一種烴類用基因工程培育成功的“超級細(xì)菌”卻能分解石油中的多種烴類化合物。,科學(xué)家還培育出能吞食轉(zhuǎn)化汞、鎘等重金屬，分解DDT等毒害物質(zhì)的細(xì)菌。,3、環(huán)境污染治理,.,利用基因工程培育的“指示生物”能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。,.,轉(zhuǎn)基因食品,安全嗎?!,.,.,轉(zhuǎn)基因抗乙肝西紅柿(中國)，雖然不能治愈乙肝，但一年只吃幾個抗乙肝西紅柿，就完全能代替注射乙肝疫苗?？挂腋挝骷t柿屬于轉(zhuǎn)基因食品，就是將乙肝疫苗植入西紅柿內(nèi)，經(jīng)過多代繁殖，使轉(zhuǎn)入的基因穩(wěn)定化。,用轉(zhuǎn)基因的植物生產(chǎn)藥物,.,轉(zhuǎn)基因植物的安全性爭論,支持派認(rèn)為：如果轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)生物技術(shù)得不到社會支持，這一研究將被扼殺，并且強(qiáng)調(diào)，迄今為止并沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品危害人體健康和環(huán)境的確切證據(jù)。,.,美國人食用轉(zhuǎn)基因食品已多年，超級市場上有4000多