細(xì)胞培養(yǎng)基本知識基本技術(shù)PPT課件

。1.細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識和技術(shù)。醫(yī)學(xué)院中心實驗室。2.主要內(nèi)容：1 .細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識。2.細(xì)胞生長的條件。3.細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)。3.1.細(xì)胞培養(yǎng)。通過機(jī)械或消化方法將獲得的組織分散成單個細(xì)胞。細(xì)胞懸浮液由培養(yǎng)基制成。在合適的體外條件下，細(xì)胞生長和繁殖，某些結(jié)構(gòu)和功能特征得以保留。培養(yǎng)細(xì)胞的特征1-生長模式和類型，附著型，懸浮型，5-培養(yǎng)細(xì)胞的特征2-增殖特征，體外培養(yǎng)的細(xì)胞不僅保持體內(nèi)細(xì)胞的某些基本特征，而且還具有一些自身的特征。附著-延伸接觸抑制-密度抑制增殖。6，附件-擴(kuò)展，7、接觸抑制。當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍，導(dǎo)致無處可去并保持接觸時，該細(xì)胞不再移動，接觸區(qū)域的細(xì)胞膜活動將停止。因此，正常細(xì)胞通常不會互相重疊生長。細(xì)胞增殖密度受到抑制。當(dāng)細(xì)胞生長合并形成單層時，細(xì)胞變得擁擠，然后分裂停止。這種細(xì)胞可以在靜止?fàn)顟B(tài)下存活一段時間，但不會繼續(xù)分裂和繁殖。轉(zhuǎn)化細(xì)胞或惡性腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的不同之處在于，它們的接觸抑制和增殖密度抑制通常降低，因此它們可以增殖至更高的終末細(xì)胞密度。培養(yǎng)細(xì)胞的特征3-生長過程，單細(xì)胞增殖：細(xì)胞周期。10、高等生物細(xì)胞周期時間長度的變化主要集中在G1期，S期、G2期和M期保持基本穩(wěn)定。Hela8-16h5-9h2-8h20-28h，11、一組細(xì)胞的增殖：細(xì)胞生長曲線，接種后，每天進(jìn)行檢測和計數(shù)，以細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制曲線。測定絕對細(xì)胞生長數(shù)的常用方法也是測定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。飽和密度：特定條件下培養(yǎng)容器中可達(dá)到的最大細(xì)胞數(shù)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度時，細(xì)胞群停止繁殖。12、潛伏期/滯留期指數(shù)生長期平臺期/停滯期退化或死亡，13，細(xì)胞系生長過程細(xì)胞系：原代培養(yǎng)的細(xì)胞在第一次傳代成功后成為細(xì)胞系，這通?？梢灾缚梢詡鞔募?xì)胞。細(xì)胞株：通過篩選或克隆從原代細(xì)胞或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的細(xì)胞。細(xì)胞系亞家族：從某一細(xì)胞系中分離出來的細(xì)胞系，其特征與原始細(xì)胞系不同，稱為亞家族。14、有限細(xì)胞系：如果傳代不能繼續(xù)或受到限制，則可稱為有限細(xì)胞系。連續(xù)細(xì)胞系：能夠連續(xù)傳代的細(xì)胞稱為“連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系”。可培養(yǎng)50代以上，可無限期培養(yǎng)。大多數(shù)二倍體細(xì)胞是有限的細(xì)胞系。大多數(shù)無限細(xì)胞系都發(fā)生了突變。嘿。15，原代細(xì)胞：從身體獲得的組織材料在體外培養(yǎng)和生長，直到第一次傳代。繼代培養(yǎng)細(xì)胞：當(dāng)原代細(xì)胞繼續(xù)生長和繁殖一段時間并達(dá)到一定細(xì)胞密度時進(jìn)行的細(xì)胞。16、培養(yǎng)瓶培養(yǎng)方法，方法：將培養(yǎng)物直接接種到培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。優(yōu)點：1、可以避免培養(yǎng)瓶表面粗糙等原因?qū)ε囵B(yǎng)的影響。2.顯微鏡觀察、染色等操作可以方便地進(jìn)行，也可以永久保存。3 .增加了培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面積。方法：將培養(yǎng)細(xì)胞接種于培養(yǎng)板的孔中，然后在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。少量培養(yǎng)也應(yīng)稱為微培養(yǎng)。懸滴培養(yǎng)法，又稱植物塊懸滴培養(yǎng)法，是最早建立的體外培養(yǎng)技術(shù)?；疽c是：將組織或器官植物塊接種在蓋玻片上，滴下一滴培養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)動蓋玻片，使植物塊和營養(yǎng)液掛在蓋玻片下，然后放在凹形玻片上，最后用蠟封好，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。哈里森用細(xì)胞培養(yǎng)解決了一個難題2.在凹面載玻片周圍涂上凡士林。將凹面滑塊向下壓向蓋玻片。3.翻轉(zhuǎn)凹面載玻片，用溶解的蠟涂抹蓋玻片。將它們放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，-Carrel和早期的組織培養(yǎng)卡氏燒瓶培養(yǎng)法，Earle，Dulbecco等人于1943年22日建立了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，并首次建立了長期傳代的L細(xì)胞系。1951年，葛伊首次建立了人類腫瘤細(xì)胞系Hela。自20世紀(jì)50年代末以來，組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)入了一個蓬勃發(fā)展的階段，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。無血清培養(yǎng)基：是一種合成培養(yǎng)基，無需添加血清即可在體外長時間維持細(xì)胞的生長和繁殖。然而，它們可能含有單獨的蛋白質(zhì)或大量的蛋白質(zhì)成分?；境煞质腔九囵B(yǎng)基和添加成分。為了觀察一種生長因子對某個細(xì)胞的影響，有必要消除其他生長因子的干擾。血清可能含有各種生長因子。另一個例子是在培養(yǎng)過程中需要測量某些細(xì)胞分泌某些物質(zhì)(抗體、生長因子)的能力?；蛘咝枰承┘?xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)來獲得它們的分泌產(chǎn)物。它們通常目標(biāo)明確，價格高。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在體外共培養(yǎng)具有三維結(jié)構(gòu)的不同材料的載體和各種類型的細(xì)胞，使細(xì)胞能夠在載體的三維空間結(jié)構(gòu)中遷移生長，形成三維細(xì)胞-載體復(fù)合體。普通的細(xì)胞培養(yǎng)由于細(xì)胞在體外環(huán)境中的增殖而逐漸失去其原有的特性，這通常與體內(nèi)情況不一致，而動物實驗完全在體內(nèi)進(jìn)行。然而，由于體內(nèi)各種因素的限制以及體內(nèi)與外部環(huán)境的相互作用，很難研究單一過程和中間過程。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)和動物實驗之間的技術(shù)。它不僅能最大限度地模擬內(nèi)部環(huán)境，而且顯示出細(xì)胞培養(yǎng)直觀、條件可控的優(yōu)點。應(yīng)用：軟骨和骨組織(軟骨細(xì)胞和干細(xì)胞，再生和受損的軟骨和骨)，循環(huán)系統(tǒng)和心臟(有目的地改變血管生成)。嘿。26、目前常用的三維培養(yǎng)模型：基質(zhì)覆蓋培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、預(yù)設(shè)支架培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、自發(fā)細(xì)胞聚集。27、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點和應(yīng)用，優(yōu)點：1)研究條件可以人為控制；2)研究樣本一致；3)研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄；4)研究成本與經(jīng)濟(jì)劣勢相關(guān)：體外培養(yǎng)的細(xì)胞不能完全等同于體內(nèi)細(xì)胞。28，應(yīng)用，病毒學(xué)：病毒鑒定，病毒抗原效應(yīng)，疫苗生產(chǎn).免疫學(xué)：雜交瘤-單克隆抗體.遺傳學(xué)：染色體分析.腫瘤學(xué)：篩選重要的抗腫瘤藥物.分化與發(fā)育：改變細(xì)胞群體的刺激.細(xì)胞毒性實驗：功效測試.臨床醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)：干細(xì)胞培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化后的移植；組織工程軟骨損傷的修復(fù)；試管嬰兒.嘿。29，營養(yǎng)需求，環(huán)境要求，無毒無污染，2，細(xì)胞生長條件，30，1，細(xì)胞營養(yǎng)需求，(1)完整培養(yǎng)基的組成，如氨基酸，維生素，碳水化合物，無機(jī)離子，(2)生長促進(jìn)因子：基礎(chǔ)培養(yǎng)基80%-95%血清5%-20%碳酸氫鈉2.0g/L青色，鏈霉素100單位/ml，31，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇，參考：(1)用于建立細(xì)胞株的培養(yǎng)基應(yīng)是培養(yǎng)這種細(xì)胞株的優(yōu)選培養(yǎng)基購買手機(jī)時，您可以咨詢參考資料或咨詢。(2)可以試用其他實驗室常用的培養(yǎng)基。許多培養(yǎng)基可以適用于多種細(xì)胞。(3)用各種培養(yǎng)基培養(yǎng)靶細(xì)胞，觀察其生長狀態(tài)，可以通過生長曲線、菌落形成率等指標(biāo)來判斷。根據(jù)實驗結(jié)果選擇最佳培養(yǎng)基是最客觀的方法，但相對復(fù)雜。常用的培養(yǎng)基類型包括RPMI-1640(標(biāo)準(zhǔn))、DMEM-高糖(標(biāo)準(zhǔn))、DMEM-低糖(標(biāo)準(zhǔn))、DMEM-F12等。如果沒有進(jìn)行細(xì)胞因子和免疫相關(guān)實驗，建議不要滅活血清。熱處理會增加血清沉淀并影響血清質(zhì)量。甚至嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長速度，細(xì)胞粘附率下降。血清中的沉淀絮狀物：解凍后，血清中的脂蛋白變性，血清中的纖維蛋白，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量。它可以通過以3000rpm離心5分鐘來去除，或者在顯微鏡下不能處理的“小黑點”:在血清熱處理后，沉淀物的形成將顯著增加。一些沉淀物在顯微鏡下看起來像“小黑點”，經(jīng)常被誤認(rèn)為是受污染的血清。正常情況下，這個小黑點不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，應(yīng)立即停止，并更換另一批血清。血清的質(zhì)量是實驗成功的關(guān)鍵。常用血清：胎牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等。胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清標(biāo)準(zhǔn)：透明、淡黃色、無沉淀、無細(xì)菌、支原體和病毒污染。碳酸氫鈉溶液(堿)的濃度為7.5%。其制備方法包括：溶于三重蒸餾水中，過濾滅菌或高壓滅菌，分裝，將HEPES(分子量238.31)溶液保存在4。一種弱酸，羥乙基哌嗪乙基磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是：防止培養(yǎng)基的快速酸堿度變化。在開放式培養(yǎng)條件下，當(dāng)觀察細(xì)胞時，培養(yǎng)基與5%CO2的環(huán)境分離，CO2氣體迅速逸出，且酸堿度迅速上升。如果加入HEPES，此時的酸堿度可維持在7.0左右。通常，HEPES是在克隆培養(yǎng)過程中加入的。最終濃度通常為10-50毫摩爾/升，通常制成1M儲存溶液：將4.76克HEPES溶于20毫升雙蒸水中，過濾、滅菌或高壓滅菌，裝在小瓶中，在4下儲存。使用時，可向100毫升培養(yǎng)液中加入2毫升HEPES濃縮液，最終濃度為20毫升/升。35歲?？股氐氖褂茫涸谂囵B(yǎng)液制備后，通常向培養(yǎng)液中加入適量的抗生素以抑制可能存在的細(xì)菌的生長。通常青霉素和鏈霉素一起使用。最終濃度為每毫升100單位。36、準(zhǔn)備1000毫升RPMI1640培養(yǎng)基、10.4克(1包)RPMI 1640干粉培養(yǎng)基、400毫升超純水，磁力攪拌至完全溶解，加入1000毫升等體積的超純水，用裝有0.22m孔徑濾膜的滅菌過濾器滅菌，分裝200毫升/瓶，并在-20下儲存?zhèn)溆?。使用前溶于瓶中，?00毫升培養(yǎng)液中加入滅活小牛血清，直至最終濃度為10%，即加入22毫升。青霉素和鏈霉素的最終濃度分別為100U/ml。嘿。37、消化液、分離的組織和分散的細(xì)胞是常用的：胰蛋白酶和二乙基氨基四乙酸二鈉(乙二胺四乙酸)單獨或組合使用。38、胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連的肽鍵，去除細(xì)胞間粘蛋白和糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而分離細(xì)胞。胰蛋白酶溶液的濃度越高，效果越強(qiáng)，但是超過一定的限度就會損傷細(xì)胞。胰蛋白酶溶液的消化時間：2-10分鐘。用含血清的培養(yǎng)液停止對細(xì)胞的消化。39、將胰蛋白酶粉末放入燒杯中，與少量的D-Hanks平衡鹽溶液混合成糊狀，然后補(bǔ)充D-Hanks平衡鹽溶液(通常濃度為0.25%)并混合均勻，將其置于室溫下4小時或冰箱中過夜，連續(xù)攪拌并振蕩第二天，用濾紙粗濾，然后過濾并滅菌，放入瓶中，在-20下保存以備后用(以避免分解失敗)。胰蛋白酶溶液是偏酸的。使用前，可用碳酸氫鈉溶液將酸堿度調(diào)至約7.2。制備胰蛋白酶溶液。40，乙二胺四乙酸四鈉溶液是一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的分散作用，毒性小，價格低廉，使用方便。常用工作液的濃度為0.02%。注意：細(xì)胞用乙二胺四乙酸處理后，應(yīng)該用平衡鹽溶液清洗干凈，因為殘留的乙二胺四乙酸會影響細(xì)胞生長。41，D-漢克斯平衡鹽溶液(D-漢克斯平衡鹽溶液，D-HBSS)。42，2。環(huán)境要求要求細(xì)胞培養(yǎng)必須具有物理和化學(xué)性質(zhì)在達(dá)到最佳溫度(37)之前，一般細(xì)胞繁殖速率隨著溫度的升高而增加，但是當(dāng)溫度逐漸升高并超過最佳溫度時，繁殖將被抑制。當(dāng)溫度為25-35時，細(xì)胞的生長速度非常慢，但它們能存活。細(xì)胞可以在4時存活幾天。只要溫度不低于0，細(xì)胞就能存活。加入保護(hù)劑后，它還可以儲存在液氮中。當(dāng)在41-42中高溫培養(yǎng)1小時時，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，如果溫度高于43，大多數(shù)細(xì)胞將死亡。高溫對細(xì)胞的影響比低溫更明顯。44、氣相和酸堿度，5% CO2，95%空氣混合氣體(O2)。CO2不僅是細(xì)胞生長所必需的，也是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，并且與維持培養(yǎng)基的酸堿度有關(guān)。最佳的酸堿值7.2-7.4低于或高于6.8，這可能對細(xì)胞有害，甚至死亡。酚紅指示器：黃色6.6橙色8.0紅色，45，3，無毒無污染，無毒：無毒是細(xì)胞培養(yǎng)的必要條件。任何與細(xì)胞直接或間接接觸的東西都必須是無毒的。如果它具有細(xì)胞毒性，細(xì)胞就容易死亡。因此，在選擇器皿和材料時必須小心。體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏人體免疫系統(tǒng)，沒有防御能力。一旦細(xì)菌和其他污染發(fā)生，細(xì)胞最終會死亡。交叉污染往往會導(dǎo)致細(xì)胞系失去其原有的特性。細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)，1。原代細(xì)胞培養(yǎng)，2。亞文化，3。培養(yǎng)細(xì)胞生長的觀察。冷凍保存、回收、運(yùn)輸和48。無菌操作中的注意事項。無菌操作時，無菌實驗室和無菌手術(shù)臺必須用紫外線燈照射30分鐘，用75%或70%的乙醇擦拭無菌手術(shù)臺，無菌手術(shù)臺風(fēng)扇應(yīng)打開10分鐘，以免污染。不要觸摸吸管尖端或容器口，也不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后，用手握住瓶蓋，握住瓶體。當(dāng)以大約45度的角度拿取容器時，注意細(xì)菌意識和無菌操作。原代細(xì)胞培養(yǎng)原理：從動物體內(nèi)取出各種組織，用各種酶(常用膠原酶)或組織貼壁法進(jìn)行處理，獲得單個細(xì)胞或細(xì)胞群，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞存活、生長和繁殖。儀器、材料和試劑：CO2培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、平板、燒杯、吸管、移液槍、手術(shù)器械、計數(shù)板、離心機(jī)、水浴箱(37)、1640/DMEMF12培養(yǎng)基(含10%血清)、2%膠原酶II、PBS、酒精，50，組織消化法，1。準(zhǔn)備：取各種無菌培養(yǎng)物，放在清洗臺上，紫外線消毒30分鐘。開始工作前，洗手并用75%酒精擦拭手肘。2.組織處理：采集的標(biāo)本必須在4小時內(nèi)完成。取出6-10厘米長的臍帶，放入燒杯或平板中，用PBS溶液沖洗2-3次，去除血跡；如果懷疑組織可能被污染，可將其放入含有鏈霉素的混合溶液中30-60分鐘。剪切：用外科剪刀將組織切成23立方毫米，然后用眼科剪刀將組織切成1立方毫米的小塊，以利于消化。加入占組織總量1: 1的2%膠原酶，然后一起倒入瓶中，密封。4.消化：使用恒溫水浴或?qū)⑵渲糜?7的培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。在消化過程中，應(yīng)該每20分鐘搖動一次。例如，最好使用電磁恒溫攪拌器進(jìn)行消化。消化時間取決于組織塊的大小和組織的硬度?？諝庹駝雍Y在37下100