DNA重組技術(shù)與基因操作.ppt

第二章DNA重組技術(shù)與基本操作,限制性內(nèi)切酶克隆載體重組基因的導(dǎo)入和篩選獲得真核生物目的基因的方法,DNA重組技術(shù)要有四個(gè)必要條件：,工具酶、基因、載體、受體細(xì)胞,DNA限制性內(nèi)切酶可分為三類：、類限制性內(nèi)切酶是基因工程中所用的主要工具酶、限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA，然后從底物上解離下來(lái)。類酶結(jié)合于特定的識(shí)別位點(diǎn)，但卻沒(méi)有特定的切割位點(diǎn)，酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性切割末端。、酶在基因工程中基本不用,第一節(jié)限制性內(nèi)切酶,一、II類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn),識(shí)別特定的核苷酸序列，其長(zhǎng)度一般為4、5或6個(gè)核苷酸且呈二重對(duì)稱，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或兼并序列；具有特定的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端；類限制修飾系統(tǒng)是由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)；限制性內(nèi)切酶、獨(dú)立的甲基化酶。,5突出粘性末端EcoRI的識(shí)別序列為3突出粘性末端Pst識(shí)別位點(diǎn)平端Sma識(shí)別位點(diǎn),5GAATTC33CTTAAG5,切割,5-G-CTTAA,AATTC-3G-5,+,5CTGCAG33GACGTC5,5-CTGCA3-G,G-3ACGTC-5,+,5CCCGGG3GGGCCC,5CCCGGG,GGG3CCC,+,二、使用限制性內(nèi)切酶時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題,1、仔細(xì)查閱酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。同裂酶：不同來(lái)源但是識(shí)別同樣順序和相同切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。同尾酶：有時(shí)有兩種限制性內(nèi)切酶識(shí)別不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所產(chǎn)生的粘性末端卻相同，這類酶為具不同酶切位點(diǎn)的DNA片段重組提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA連接酶連接后，都不能再被其切割了。,2、注意酶反應(yīng)條件，相同反應(yīng)條件的酶可以同時(shí)酶解DNA樣品。3、注意說(shuō)明書中所列出的comments的內(nèi)容，會(huì)提供有關(guān)限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列中位點(diǎn)特異性甲基化的信息以及引起酶產(chǎn)生staractivity的原因。staractivity：指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時(shí)，其在識(shí)別序列中的酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。產(chǎn)生的原因：反應(yīng)體系中甘油的濃度12；酶：DNA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。,4、注意酶的濃度，酶切時(shí)不是酶加得越多越好。一般以在20l反應(yīng)體積中，37，每小時(shí)水解1微克DNA的酶量定為一個(gè)酶單位。5、注意酶在保溫過(guò)程中的活性變化。ACC在5小時(shí)內(nèi)具有全部活力BamH在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)具有全部活力，在第二小時(shí)具有部分活力，而在2小時(shí)以后就無(wú)活力了。Cfo僅在第一個(gè)小時(shí)內(nèi)具有全部活力，一個(gè)小時(shí)以后就沒(méi)有活力了。,三、連接酶定義：用于將兩端乃至數(shù)段DNA片段拼接起來(lái)的酶。用途：（1）、連接帶匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的雙鏈DNA分子相互連接或與合成的寡核苷酸接頭相連接。這類反應(yīng)要比粘末端之間連接慢得多，但單價(jià)陽(yáng)離子（150-200mmol/LNacl）或低濃度的聚乙二醇（PEG）可提高連接效率。,四、修飾酶,1、DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（klenowfragment）、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬菌體DNA聚合酶、耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反轉(zhuǎn)錄酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等2、依賴于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶用途:在invitro條件，合成單鏈RNA作為雜交探針。,3、T4噬菌體多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA片段的5末端。用途：標(biāo)記DNA片段的5端，制備雜交探針；基因化學(xué)合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于測(cè)序引物的5標(biāo)記。,532P,OH3,HO,32P,3,5,32PATP,4、堿性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重組中自身環(huán)化，從而提高重組效率；在用32pATP標(biāo)記DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非標(biāo)記的5磷酸。,5P,OH3,HO,P,3,5,5突出末端,5隱蔽末端,OH,HO,5HO,OH3,3,5,第二節(jié)克隆載體,基因工程載體應(yīng)具備的條件：能自我復(fù)制并能帶動(dòng)插入的外源基因一起復(fù)制；具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)：在載體上單一的限制性酶切位點(diǎn)越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便的插入載體；在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴(kuò)增；載體的分子量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段：在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失；應(yīng)該有一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記。,大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)具備：強(qiáng)的啟動(dòng)子，一個(gè)強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄；在啟動(dòng)子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個(gè)好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）；在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個(gè)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。,一、質(zhì)粒,定義：質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體之外的方式存在。,A,B,OC,SC,L,F質(zhì)粒：有些攜帶有幫助其自身從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個(gè)細(xì)胞的信息的質(zhì)粒。R質(zhì)粒：表達(dá)對(duì)一種抗生素的抗性的質(zhì)粒。降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因的質(zhì)粒。穿梭載體：在大腸桿菌的載體上放上第二個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，使它在另一個(gè)宿主細(xì)胞中也能進(jìn)行復(fù)制。,1、質(zhì)粒載體pBR322大小為4363bp；含有兩個(gè)抗生素基因（抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素）；有單一的BamH、Hind和Sal的識(shí)別位點(diǎn)（在四環(huán)素抗性基因內(nèi)）、Pst識(shí)別位點(diǎn)（在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)）；外源片段在BamH、Hind、Pst位點(diǎn)插入時(shí)，可引起抗生素失活來(lái)篩選重組體。帶有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，可以保證這個(gè)質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復(fù)制功能，在大腸桿菌里pBR322以高拷貝數(shù)存在。,2、質(zhì)粒載體pUC19大小為2686bp；帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因；一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖苷酶基因的調(diào)節(jié)片段（lacZ）,一個(gè)調(diào)節(jié)lacZ基因表達(dá)的阻遏蛋白的基因lacI；含有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。,pUC19的篩選：培養(yǎng)基中含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操縱子的一個(gè)誘導(dǎo)物）時(shí)，lacI的產(chǎn)物就不能與lacZ的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，質(zhì)粒pUC19的lacZ就可以轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯，lacZ蛋白會(huì)與染色體DNA編碼的一個(gè)蛋白形成具有活性的雜合半乳糖苷酶。在底物5溴4氯3吲哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal會(huì)被雜合半乳糖苷酶水解成藍(lán)色的產(chǎn)物，沒(méi)有插入外源DNA序列的pUC19質(zhì)?？寺【统仕{(lán)色。由于pUC19的單克隆位點(diǎn)的序列是整合在lacZ之中的，若pUC19質(zhì)粒中插入有目的DNA片段，就會(huì)破環(huán)lacZ的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無(wú)法形成雜合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。,穿梭質(zhì)粒:人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。,二、噬菌體,噬菌體可以進(jìn)入裂解循環(huán)，20分鐘后就可使宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，同時(shí)釋放出大約100個(gè)噬菌體顆粒。噬菌體也可以進(jìn)入溶源循環(huán)，即注入的DNA整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來(lái)，永久保留；但在某種營(yíng)養(yǎng)條件或是環(huán)境脅迫條件下，整合的噬菌體DNA可以切割出來(lái)進(jìn)入溶源循環(huán)。,噬菌體DNA大約長(zhǎng)50kb，其中大約20kb對(duì)于整合切割過(guò)程極為關(guān)鍵，稱為整合切割（I/E）區(qū)域。對(duì)于構(gòu)建文庫(kù)，可將這20kbDNA片段去掉，強(qiáng)迫重組的噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。,整合切割區(qū)域,尾部基因,頭部基因,粘性末端,粘性末端,負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的基因,細(xì)胞裂解基因,噬菌體的DNA示意圖,左臂,右臂,噬菌體頭的大小足以裝下50kb單元的線性DNA，DNA52kb,則無(wú)法包裝進(jìn)頭部。cos位點(diǎn)（cossite）就是保證在超長(zhǎng)線性DNA分子上每?jī)蓚€(gè)cos位點(diǎn)之間為50kb,使DNA分子能正確的裝配進(jìn)噬菌體。在頭的入口處有一種酶，它能識(shí)別雙鏈線性DNA分子上的cos序列，并在cos序列處切斷DNA分子，使適當(dāng)大小的DNA進(jìn)入噬菌體的頭部。,噬菌體DNA分子示意圖,三、柯斯質(zhì)粒（cosmid）可攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)勢(shì)?？滤官|(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位點(diǎn)、兩個(gè)cos位點(diǎn)、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間含有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE）。,四、YAC載體目前能容納最大外源DNA片段的載體是YAC（酵母人工染色體，yeastartificialchromosome）。真核生物染色體三個(gè)關(guān)鍵部分：著絲粒（centromere,CEN）,它主管染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中正確的分配到各子細(xì)胞中；端粒（telomere,TEL）,位于染色體的末端，對(duì)染色體末端的復(fù)制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要的意義；自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）,即在染色體上的多處DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。,作為真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備如下條件：含有原核基因的復(fù)制起始序列（如ColE1起始序列ori）篩選標(biāo)記；含有真核基因的復(fù)制起始序列（如SV40病毒的復(fù)制序列、酵母的2質(zhì)粒的復(fù)制起始序列ARS、以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母細(xì)胞中與自養(yǎng)有關(guān)的基因）；含有有效地啟動(dòng)子序列（可包含增強(qiáng)子序列等各種順式作用元件）；RNA聚合酶所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號(hào)序列；合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。,應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體進(jìn)行基因克隆的一般程序,利用柯斯質(zhì)?？寺〈笃蜠NA,pYAC4結(jié)構(gòu)圖,YAC的構(gòu)建示意圖,第三節(jié)重組基因的導(dǎo)入和篩選,氯化鈣法電穿孔：將宿主細(xì)胞置于一個(gè)高強(qiáng)電場(chǎng)中，通過(guò)電場(chǎng)脈沖在細(xì)胞壁上打孔，DNA分子隨即進(jìn)入細(xì)胞。聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：常用于轉(zhuǎn)化酵母以及其他真菌細(xì)胞活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理變成球形后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介導(dǎo)下將外源DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中。,磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的常規(guī)方法。磷酸鈣和DNA共沉淀：將被轉(zhuǎn)染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞。DEAE葡聚糖作用：可能是其與DNA結(jié)合從而抑制核酸酶的作用或與細(xì)胞結(jié)合從而促進(jìn)DNA的內(nèi)吞作用。,原生質(zhì)體融合：通過(guò)帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。脂質(zhì)體法：將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)搿＜?xì)胞核的顯微注射法：即將目的基因重組體通過(guò)顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中。,基因重組的方法：根據(jù)外源DNA片段末端的性質(zhì)同載體上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)相連實(shí)現(xiàn)基因的體外重組。當(dāng)在載體的以及外源DNA片段兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，可采用下述方法解決：在線狀質(zhì)粒的末端或外源DNA片段的末端用DNA連接酶接上接頭或銜接頭，這種接頭可以是含單一的或多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，然后通過(guò)適當(dāng)?shù)南拗泼附夂筮M(jìn)行重組。,使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3凹端。3凹端轉(zhuǎn)變成粘端。使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3凹端完全補(bǔ)平或用S1核酸酶、綠豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去除3突出端產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA分子相連?？梢岳媚┒宿D(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3端加上相互補(bǔ)的同聚尾同聚物加尾法，常用于雙鏈cDNA的分子克隆。,Pst1,質(zhì)粒,pG,CTGCA,ACGTC,Gp,CTGCAGGGGGG,pG,Gp,GGGGGGACGTC,AAAAAAA,mRNA,AAAAAAA,TTTTTTT,TTTTTTT,AAAAAAA,AAAAAAACCCCCC,TTTTTTT,CCCCCC,用末端轉(zhuǎn)移酶加（dG）殘基,用末端轉(zhuǎn)移酶加（dC）殘基,以oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈,合成cDNA第二鏈,退火,CTGCAGGGGG,AAAAAAACCCCCCG,GCCCCCC,TTTTTTTGGGGGGACGTC,轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株選擇抗生素抗性,轉(zhuǎn)化過(guò)程中，DNA上的缺口為宿主酶所修復(fù)，從而在cDNA兩端恢復(fù)Pst1位點(diǎn),Pst1,Pst1,cDNA,多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）為基因定向重組和構(gòu)建外源基因高效表達(dá)治理提供了一個(gè)通用方法。根據(jù)載體上的克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，使引物上帶有與載體克隆位點(diǎn)相匹配的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。,篩選,1、重組質(zhì)粒的快速鑒定：根據(jù)有外源基因插入的重組質(zhì)粒同載體DNA之間大小的差異區(qū)分。2、重組質(zhì)粒的限制酶解分析。3、通過(guò)互補(bǔ)使菌落產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來(lái)篩選重組體。4、外源DNA片段插入失活。如果載體帶有兩個(gè)或多個(gè)抗生素抗性基因并在其上分布適宜的可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時(shí)，當(dāng)外源DNA片段插入到一個(gè)抗性基因中去時(shí)可導(dǎo)致此抗性基因失活。,5、分子雜交篩選法：原位雜交點(diǎn)雜交和southern雜交,5,3,變性、轉(zhuǎn)膜,3,5,加入經(jīng)標(biāo)記、變性的探針進(jìn)行分子雜交,3,5,3,3,5,5,*,*,含有雜交信號(hào)的DNA分子,6、表達(dá)文庫(kù)的免疫學(xué)篩選：絕大多數(shù)構(gòu)建噬菌體的cDNA文庫(kù)選用gt11、ZAP或ORF8作為表達(dá)載體。這些噬菌體帶有一拷貝的大腸桿菌LacZ基因，克隆位點(diǎn)位于翻譯終止密碼子上游53bp處。cDNA插入方向和閱讀框正確時(shí)，可以表達(dá)氨基端為半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列將暴露出可用特異抗體檢測(cè)的抗原表位。,在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落,轉(zhuǎn)膜,菌落的蛋白質(zhì)裸露出來(lái),一抗與裸露的蛋白質(zhì)結(jié)合,二抗與一抗結(jié)合,顯色,找出陽(yáng)性克隆,裂解,加一抗,洗去游離的一抗，加二抗,洗去游離的二抗，加顯色劑,7、利用PCR方法來(lái)確定基因的重組體。,克隆PCR產(chǎn)物；通用引物：pUC/M13primer,8、DNA的序列分析：這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相同序列的唯一方法，也是最確定的方法。,第四節(jié)獲得真核生物目的基因的方法,一、cDNA的方法分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞：所用材料要盡量新鮮mRNA的分離第一鏈cDNA鏈的合成第二條cDNA鏈的合成cDNA的甲基化和接頭的加入雙鏈cDNA與載體相連：插入片段：載體1：13：1基因文庫(kù)的建立,mRNA的分離poly(A)尾巴可以用來(lái)把mRNA同rRNA和tRNA分離開(kāi)來(lái)：1、先提取真核細(xì)胞的總RNA；2、把總RNA通過(guò)一個(gè)用纖維素填充的柱子；在纖維素上結(jié)合有許多長(zhǎng)度大約為15個(gè)核苷酸的短鏈寡聚dToligo(dT)或dT15，真核基因mRNA分子的poly(A)尾巴通過(guò)堿基配對(duì)作用與oligo(dT)結(jié)合，而其它的RNA成分因?yàn)闆](méi)有poly(A)尾巴而不能結(jié)合3、真核生物mRNA可以用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫下來(lái)。,第一鏈cDNA鏈的合成mRNA純化以后，樣品中加入短的oligo(dT)或隨機(jī)引物分子作為引物，同時(shí)加入逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。優(yōu)點(diǎn)：可以最大限度的減少poly(A)模板合成cDNA的可能性；缺點(diǎn)：cDNA合成總是從mRNA3端開(kāi)始，在最后的cDNA文庫(kù)中，代表mRNA3區(qū)域的組分所占的比例會(huì)高，而且對(duì)于一些較長(zhǎng)的mRNA分子來(lái)說(shuō)，由于反轉(zhuǎn)錄酶在cDNA合成過(guò)程中易從mRNA分子上脫開(kāi)，從而造成第一條鏈合成不完整。,oligo(dT)作為引物,優(yōu)點(diǎn)：合成的cDNA文庫(kù)可能更好地代表最初RNA模板所代表的組份；缺點(diǎn)：由于cDNA在RNA鏈上的合成是隨機(jī)的，易產(chǎn)生較大量的非全長(zhǎng)的RNA模板轉(zhuǎn)錄物，從而影響到全長(zhǎng)的cDNA分子的獲得率。因此用總體RNA和oligo(dT)引物是最有效的組合。用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成的DNA鏈往往不完整，但有一個(gè)特點(diǎn)：在合成停止前，DNA鏈會(huì)自己折轉(zhuǎn)回來(lái)幾個(gè)核苷酸形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。,隨機(jī)引物,第二條cDNA鏈的合成自身引導(dǎo)法：利用經(jīng)一條鏈上的3端序列的折回或發(fā)卡自引導(dǎo)法來(lái)合成效率低，目前已不多用。cDNA第二條鏈的置換合成法：作為第一條鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物的cDNA：mRNA雜交分子充當(dāng)切口平移的模板。RNaseH在雜交分子上的mRNA鏈上造成切口，產(chǎn)生一系列的RNA引物，它們被E.coli的DNA聚合酶I用以合成第二鏈效率高，直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無(wú)須進(jìn)一步處理和純化；省去S1酶的處理，改善了cDNA的質(zhì)量，使產(chǎn)生全長(zhǎng)的cDNA的機(jī)率大大提高。引物銜接頭法合成雙鏈cDNA：通過(guò)將cDNA兩端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，使其較方便的克隆入相應(yīng)的載體。,自身引導(dǎo)法,反轉(zhuǎn)錄酶,RNaseH（部分降解）,DNA聚合酶,DNA聚合酶,DNA連接酶,RNA,5,5cDNA第一鏈,3,3RNA,5,5,5,5,5,5,5,5cDNA第一鏈,3cDNA第二鏈,置換合成法,基因文庫(kù)的建立基因文庫(kù)：指將基因組DNA通過(guò)限制性內(nèi)切酶部分酶解后（必要時(shí)對(duì)這些DNA片段進(jìn)行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進(jìn)行分級(jí)分離，以選擇長(zhǎng)度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機(jī)地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。,二、DNA的化學(xué)合成,1、基因片段的全化學(xué)合成特點(diǎn)：首先合成組成一個(gè)基因的所有片段，相鄰的片段間有46堿基的重疊互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)退火后，用T4DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價(jià)鍵形式連接成一個(gè)完整的基因?；瘜W(xué)合成的DNA片段純化后其5和3端都為羥基，在組建基因前要將DNA片段的5端磷酸化（處于基因5端的兩個(gè)寡核苷酸片段不進(jìn)行磷酸化，以防止基因本身在DNA重組時(shí)自身環(huán)化）。,基因的化學(xué)合成及克隆圖解,退火,DNA連接酶,Amp,Tet,AmprTett,合成的基因,2、基因的化學(xué)酶促合成特點(diǎn)：不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片斷，相鄰的3末端有一短的序列互補(bǔ)，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過(guò)退火形成模板引物的復(fù)合體，然后在存在四種dNTP的條件下，用E.coli的DNA聚合酶大片段（klenow大片段）去填補(bǔ)互補(bǔ)片段之間的缺口，最后用T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體。,基因的化學(xué)酶促合成圖解,退火,DNA多聚酶Iklenow片段dNTP,限制性內(nèi)切酶,分子克隆,5,5,5,5,三、利用PCR或RT-PCR分離基因1、反應(yīng)體系具備的條件：要有與被分離的目的基因5和3端序列互補(bǔ)的DNA引物（約20個(gè)堿基左右）；具有熱穩(wěn)定性的酶，如TaqDNA聚合酶；dNTP；作為模板的DNA分子。,2、過(guò)程：變性：模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈；退火：將反應(yīng)體系的溫度降至55左右，使得一對(duì)引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)；延伸：將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72，然后以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。,3、引物設(shè)計(jì)原則：3末端序列不能有明顯的互補(bǔ)性易造成引物間二聚體，導(dǎo)致非特異DNA片段的合成；避免引物分子內(nèi)序列互補(bǔ)導(dǎo)致引物分子內(nèi)雙鏈區(qū)或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，引物3端形成的發(fā)夾環(huán)會(huì)引起引物內(nèi)延伸，而發(fā)生在近5端對(duì)PCR的影響不大；注意熔點(diǎn)溫度。注意引物內(nèi)穩(wěn)定性：5末端穩(wěn)定而其3末端不穩(wěn)定的引物是進(jìn)行PCR合成的好引物。當(dāng)利用哺乳動(dòng)物類基因組序列作為PCR模板時(shí)，對(duì)所用的引物要檢查其同Alu序列或其它短的重復(fù)序列的互補(bǔ)性。,逆轉(zhuǎn)錄PCR（retrotranscriptionPCR,RT-PCR）:,以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與RNA互補(bǔ)的DNA鏈即cDNA,然后以cDNA鏈為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。,帽子,AAAAAmRNA,3,5,TTTTT,以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,逆轉(zhuǎn)錄,合成cDNA互補(bǔ)鏈并退火,寡聚dT引物,是檢測(cè)RNA分子的良好方法，也是獲取測(cè)序用模板DNA的有效手段，同時(shí)還是克隆mRNA之cDNA的重要步驟。RT-PCR具有很高的敏感性,可以用來(lái)分析不同組織或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達(dá)狀況的相關(guān)性；可以用來(lái)研究低表達(dá)活性基因的mRNA生理變化動(dòng)態(tài)。,判斷根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中樣品條帶的強(qiáng)度比較，便能確定兩種PCR反應(yīng)產(chǎn)物之間的數(shù)量關(guān)系。前提條件所測(cè)定的mRNA分子必須來(lái)自由一個(gè)或數(shù)個(gè)間隔子的基因。,錨定PCR：,特別適合預(yù)擴(kuò)增那些只知道一段序列的目的DNA。對(duì)于一端序列已知，一端序列未知的DNA片段，可以通過(guò)DNA末端轉(zhuǎn)移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。,5,3,DNA序列,錨定引物,CCCCC（多聚dC引物）,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,5,GGGGG3,CCCCC,加多聚dG尾巴,加入引物,已知序列,擴(kuò)出的未知序列,反向PCR,特別適合用于擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列方法：選擇一個(gè)在已知序列中沒(méi)有，而在其兩側(cè)都存在的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序列位于環(huán)狀分子上，根據(jù)已知序列的兩端序列設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，以環(huán)狀分子為模板進(jìn)行PCR，就可以擴(kuò)增出已知序列兩側(cè)的未知序列。,L,R,酶切位點(diǎn),酶切位點(diǎn),L,R,L,R,L,R,5,3,已知序列,限制性內(nèi)切酶酶解,環(huán)化,變性并加入根據(jù)已知序列合成的引物,PCR擴(kuò)增,四、SSH與mRNADD,差減雜交是利用目的基因在兩種組織或細(xì)胞中表達(dá)的差異，其mRNA或單鏈cDNA進(jìn)行液相雜交，除去兩者之間相同的基因成分取得。抑制消減雜交法(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是抑制PCR和消減雜交法為基礎(chǔ)，在一輪反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)mRNA的均等化和消減步驟，從而有效鑒別兩個(gè)不同細(xì)胞群差異表達(dá)基因。,mRNA差異性顯示(differentialdisplay,DD)，又稱差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR），是判斷特定條件下基因差異性表達(dá)的常用方法。所有真核生物成熟的mRNA3，端均有poly(A)結(jié)構(gòu)，而且其3端與poly(A)相鄰的12組堿基組合，設(shè)計(jì)的引物的12組針對(duì)mRNA與poly(A)相鄰的12組堿基的配對(duì)堿基稱為錨定堿基：mRNA3GGGCGTGACCCGCACTTTTGTCTA錨定堿基5CCCGCACTGGGCGTGAAAACAGAT,它通過(guò)利