蛋白純化硫酸銨沉淀鹽析法

蛋白純化硫酸銨沉淀鹽析法法還能想起那些在熒屏中曾經(jīng)震撼過我們，具有超能力的英雄么？蜘蛛俠，敏捷，靈活迅速飛流直下，忽閃直沖高樓；綠巨人浩克，力量，速度，耐力，在我們的想象力中膨脹；還有，我們隨身攜帶星形盾牌，品格高尚的美國隊(duì)長幻想里中的人物形象存在我們的記憶力，然而生物背景出身的我們，總歸要鍛煉出屬于自己的實(shí)驗(yàn)技能，即便是相同的實(shí)驗(yàn)步驟，每個人做出來的結(jié)果也不盡相同，差別在哪？反復(fù)練習(xí)，用心總結(jié)出屬于自己的心得，轉(zhuǎn)化為自己的實(shí)驗(yàn)“超能力”吧。本文總結(jié)了蛋白純化硫酸銨沉淀詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)原理、步驟，供大家參考。 -鍛煉屬于我們自己的實(shí)驗(yàn)“超能力”之一我是超級蜘蛛精看我有勁兒不？而我是一只冷靜的科研小蝸牛沖啊，我是美國隊(duì)長這次，我們所要分享的便是一種很常見，但是也很重要的蛋白質(zhì)純化方法：硫酸銨沉淀蛋白法，一起走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室吧。硫酸銨沉淀法是粗分離蛋白時常用的純化和濃縮蛋白的技術(shù)。蛋白質(zhì)的溶解度和鹽濃度密切相關(guān)，在低濃度的條件下，隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)的溶解度增加；但在高濃度的鹽溶液里，鹽離子競爭性的結(jié)合蛋白表面的水分子，破壞蛋白表面的水化膜，溶解度降低，蛋白質(zhì)在疏水作用下聚集形成沉淀。每種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因此可以用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。硫酸銨的溶解度大，解離形成大量的NH4+、SO42-離子，會結(jié)合大量的水分子，使蛋白質(zhì)的溶解度下降，另外，其溫度系數(shù)小，不易使蛋白質(zhì)變性，因此，蛋白質(zhì)粗分離時硫酸銨沉淀法是很重要的一種技術(shù)，后續(xù)可采用層析技術(shù)進(jìn)一步純化蛋白，效率更高。硫酸銨沉淀法是常用的分離免疫球蛋白的方法。各種不同蛋白質(zhì)鹽析需要不同濃度的硫酸銨溶液。在實(shí)驗(yàn)中建議配置不同梯度濃度的硫酸銨溶液來確定蛋白質(zhì)沉淀所需的最佳濃度。（1） 參照如下表格配置不同濃度的硫酸銨溶液；例如，在25 條件下，配置飽和度為100 %的硫酸銨溶液，稱取767 g的硫酸銨固體，邊攪拌邊加入到1 L的蒸餾水中，完全溶解后，用氨水或者硫酸調(diào)節(jié)pH到7.0。（2） 沉淀蛋白將樣品離心，去除沉淀，保留上清液并測量體積；一邊攪拌一邊慢慢的加入硫酸銨。接著，將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6 h，或者4 ，攪拌過夜，使蛋白質(zhì)充分沉淀。加入硫酸銨有兩種方式，一種是直接加入硫酸銨固體，在操作上速度緩慢，不易太快，否則會造成蛋白變性；另一種方式是加入飽和的硫酸銨液體，但若需要較高濃度的硫酸銨溶液，需要加入較大體積的飽和硫酸銨溶液，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中，因蛋白質(zhì)上清液和硫酸銨飽和溶液的體積之和過大，離心機(jī)無法離心，因此根據(jù)需要加入的硫酸銨飽和溶液的體積選擇合適的方法。另外，每種蛋白質(zhì)沉淀所需要的硫酸銨溶液的濃度也不同，因此在每次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該做好觀察記錄，積累經(jīng)驗(yàn)值。分享來自網(wǎng)上的一種簡單的方法來估計蛋白沉淀所需要的硫酸銨溶液的濃度范圍，供大家參考：將蛋白質(zhì)溶液分成5份，每份分別加入硫酸銨至濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%，離心，棄蛋白質(zhì)沉淀，留取上清，再向上清液中加入硫酸銨，使得濃度從原先的20%升高到30%，30%的濃度升到40%，40%的濃度升為50%.，離心保留沉淀，分析沉淀中是否含有目的蛋白，以此確定沉淀目的蛋白所需要的最佳硫酸銨溶液的濃度。（3） 透析除去硫酸銨將蛋白質(zhì)溶液離心沉淀，棄上清保留沉淀。加入10-20 ml的PBS-疊氮化鈉溶液溶解蛋白質(zhì)，疊氮化鈉不于蛋白質(zhì)反應(yīng)，但能防止蛋白質(zhì)變性。蛋白沉淀溶解之后，放入透析袋中透析24-48 h，每隔5 h更換透析液除去硫酸銨。收集透析液，離心，測