等電焦集法PPT課件

1 蛋白質(zhì)電泳檢測 1電泳原理蛋白質(zhì)的泳動率電泳的種類電泳設(shè)備及系統(tǒng)選擇2聚丙烯醯胺膠體電泳PAGE種類PAGE膠體的組成膠體主要成分鑄膠反應(yīng)PAGE系統(tǒng)解剖電泳系統(tǒng)的組成電泳的焦集作用兩種電泳系統(tǒng)比較 3其它相關(guān)技術(shù)染色及乾燥等電焦集法 IEF 二次元電泳蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印法 2 電泳原理 所外加電壓mV 分子之淨(jìng)電荷密度 泳動率 分子與介質(zhì)間之摩擦力上述之摩擦力 決定於此分子之大小 形狀 分子量大者摩擦力大 泳動率小 球形分子摩擦力較小 泳動率大 3 以電泳確定蛋白質(zhì)的分子量 4 5 6 電泳的種類 a 全液相電泳b 帶狀電泳 zoneelectrophoresis 1 濾紙電泳 2 薄層電泳 3 膠體電泳 7 其它電泳技術(shù) 1 等電焦集法 isoelectricfocusing 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同來做分離 2 勝汰圖譜 peptidemapping 不同的蛋白質(zhì)有不同的勝汰圖譜 3 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印 Westernblotting 免疫染色 immunostainning 4 製備式電泳 preparativeelectrophoresis 可以純化高純度蛋白質(zhì) 5 免疫電泳 immunoelectrophoresis 電泳後再以抗體與抗原反應(yīng) 可產(chǎn)生沉澱線 也是有兩個次元 6 毛細(xì)管電泳 capilliaryelectrophoresis 最新的電泳儀器 有點(diǎn)像HPLC 7 Pulsefieldgelelectrophoresis 可做大分子DNA甚或染色體之分離 8 9 聚丙烯醯胺膠體電泳 Disc PAGE是PAGE系列的最基本型式 蛋白質(zhì)以原態(tài)進(jìn)行電泳 因此酵素活性在電泳後得以保持 可在膠片上直接做活性測定或染色 若能收集到膠體上的蛋白質(zhì) 則亦可用來製備酵素 因?yàn)闃颖镜鞍踪|(zhì)保持在原態(tài)下 所帶的電荷 分子大小 分子形狀等 對其泳動率均有影響 10 SDS PAGE SDS是界面活性劑 可使蛋白質(zhì)變性 並在分子表面均勻佈上一層負(fù)電荷 因此在SDS PAGE系統(tǒng)中 樣本分子的泳動率 僅取決於其分子量 而與原來分子所帶的電荷無關(guān) 故SDS PAGE可用來測定變性狀態(tài) denatured 蛋白質(zhì)之分子量 與原態(tài) native 分子量可能不一樣 11 12 PAGE電泳膠體系統(tǒng)的各組成部份 13 a 單體分子 monomer 丙烯醯胺 acrylamide H2C CH CO NH2 b 架橋分子 bridge Bis N N methylene bis acrylamide 可看作兩個丙烯醯胺單體分子連結(jié)在一起 可形成分叉點(diǎn) 以構(gòu)成立體結(jié)構(gòu) c 游基 freeradical 產(chǎn)生者通常使用過硫酸銨 ammoniumpersulfate APS 或者riboflavin 即維生素B2 d 催化劑TEMED tetramethylethylenediamine 幫助游基電子的傳遞 PAGE膠體的組成 14 膠體聚合反應(yīng) a 游基形成靠上述游基產(chǎn)生者生成游基 再使單體分子成為游基型式 膠體聚合反應(yīng)b 聚合反應(yīng)游基單體可首尾相接 以連鎖反應(yīng)形成大分子的長鏈 膠體聚合成網(wǎng)狀構(gòu)造c 交錯連結(jié)若架橋分子加入聚合反應(yīng) 則形成網(wǎng)狀三次元結(jié)構(gòu) 15 16 17 直立式柱狀電泳 18 SDS PAGE分離蛋白質(zhì) 19 梯度電泳系統(tǒng) 梯度電泳使用由稀到濃的梯度膠體 膠體中的孔徑由上到下逐漸變小 樣本中分子量越小的分子 就可跑得越下面 因此它可說是依分子量大小來分離的 但需注意許多pI大於8 3的蛋白質(zhì) 在電泳pH條件下所帶的淨(jìng)電荷為正 在膠體中根本不會往下跑 梯度電泳也可加入SDS 成為梯度 SDS PAGE 則解析度將會大大的增強(qiáng) 是最理想的電泳型式 20 21 上述組成電泳的五個部分中 只有膠體的緩衝液含氯離子 而樣本溶液中則含有g(shù)lycine 沒有氯子 樣本溶液 焦集膠體 分離膠體三段的pH是不連續(xù)性的 其pH分別為8 3 6 9 8 9 而glycine的pI恰為6 9電泳一開始glycine進(jìn)入焦集膠體 立刻變成不帶電的的分子 白點(diǎn) 泳動率變小 同時氯離子則很快的往正極泳動 因此在氯離子與glycine之間有一段缺乏離子的空間 電壓變得很高 焦集膠體對蛋白質(zhì)分子的焦集作用 22 然而兩電極之間 要有負(fù)離子來帶動電流 此時只得利用蛋白質(zhì)來傳導(dǎo) 而焦集膠體中的孔隙較疏 於是樣本分子不論大小 在此離子缺乏空間 全部快速往正極泳動 一直碰到氯離子的尾端聚集成一薄層Glycine慢慢通過焦集膠體 變回負(fù)離子 離子缺乏帶瓦解 蛋白質(zhì)泳動到分離膠體 開始依其分子量 電荷等因素泳動 23 24 25 26 染色及乾燥 a 一般染色法 1 硝酸銀 ammoniacalsilver 染色 2 CoomassieBrilliantBlueR 250 CBR 染色b 醣蛋白c 紫外線照射d KCl沈澱法 27 Disc PAGE與SDS PAGE的比較 28 e 活性染色法f 放射顯像法 autoradiography 可檢測樣本中的放射性物質(zhì) 但要以 光片壓片顯影 g 膠片乾燥法 29 30 31 32 電泳結(jié)果不佳分析 a 膠體不凝結(jié)檢查ammoniumpersulfate TEMED acrylamide等試劑品質(zhì)是否良好 或是APS濃度太稀 室溫太低亦不易凝結(jié) 要稍加高APS的濃度 33 b 膠體凝結(jié)不良成為半固體粘液狀時 檢查膠體溶液的百分比對否 是否忘了加Bis 所用的acrylamide品質(zhì)是否良好 c 下雨染色後有許多垂直細(xì)線 下雨 可能是膠片中有小氣泡 或是樣本中有不溶物質(zhì) 或所用樣本溶液中的b mercaptoethanol品質(zhì)不佳 acrylamide溶液變質(zhì)產(chǎn)生固體微粒後 也可能有下雨現(xiàn)象 34 d 色帶扭曲染出的色帶形狀扭曲 如波浪狀 可能是蛋白質(zhì)溶解度不好 或樣本中含太高的鹽類 凝膠不均勻時 也會有色帶扭曲的現(xiàn)象 可能是APS沒有溶解完全 e 樣本干擾物質(zhì)色帶擴(kuò)散太過 有嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象 或左右拉寬 可能是樣本液的pH不對 一般是過酸 或者樣本中的鹽濃度太高 f 溫度不均膠片左右兩邊泳動的速度不一時 請檢查跑得慢的那個方向 有無冷氣或風(fēng)扇吹來 降低一邊膠片的溫度 35 g 無