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FISH檢測HER-2的意義乳腺癌有效的治療取決于正確的選擇治療方案，腫瘤專家研究發(fā)現(xiàn)HER-2的水平是以阿霉素為基礎(chǔ)藥物化療重要而獨(dú)立的預(yù)后因子。HER-2水平的檢測被認(rèn)為是選擇乳腺癌化療的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。 HER-2水平的檢測對乳腺癌治療具有指導(dǎo)性意義。不準(zhǔn)確的結(jié)果會(huì)造成不正確的治療方案。導(dǎo)致病人遭受不必要的化療或者使病人喪失有效的治療良機(jī)。HER-2/neu也稱作CerbB-2，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長中起著重要的作用，是分子量為185kd的轉(zhuǎn)膜細(xì)胞受體，屬于酪氨酸酶家族的成員。HER-2被證實(shí)在乳腺癌、卵巢癌和其它腫瘤上擴(kuò)增和過表達(dá)。其擴(kuò)增和過表達(dá)被認(rèn)為是乳腺癌最重要預(yù)后和化療標(biāo)記。大約有25%-30%乳腺癌有HER-2基因擴(kuò)增?；熓侨橄侔┬g(shù)后最重要的治療方法之一，患者腫瘤HER-2擴(kuò)增對以阿霉素為基礎(chǔ)化療的敏感性好，研究表明，HER-2擴(kuò)增的病人實(shí)施強(qiáng)化劑量的化療后其生存率明顯提高。而對無HER-2擴(kuò)增的病人沒有那么好的效果。所以對無HER-2擴(kuò)增的病人沒有必要執(zhí)行這樣的化療。準(zhǔn)確的HER-2水平檢測為正確選擇治療方案提供重要依據(jù)。目前用于治療乳腺癌的單克隆抗體Herceptin理論上只對細(xì)胞膜上過多HER-2蛋白表達(dá)的細(xì)胞才有作用，所以Herceptin治療需要篩選HER-2陽性的患者才有可能成功。目前檢測HER-2基因擴(kuò)增或HER-2蛋白過度表達(dá)的方法有許多種，有南方點(diǎn)墨法、西方點(diǎn)墨法、北方點(diǎn)墨法、免疫組織化學(xué)染色法（IHC）和熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization;FISH）等。目前DAKO Herceptin test，Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe試劑盒和Oncor INFORM HER-2/neu已通過美國食品藥物管理局（FDA）的認(rèn)證，目前被認(rèn)為是比較可靠的方法。IHC和FISH均可以使用福爾馬林固定的組織蠟塊來檢測，和一般病理組織標(biāo)本處理相同，病理存檔的組織塊也能用于HER-2的檢測，因此目前實(shí)驗(yàn)室多數(shù)使用IHC和FISH來檢測HER-2。Herceptin test 和FISH相比Herceptin test操作時(shí)間比較短，大約4-6個(gè)小時(shí)即可完成，而FISH需要隔夜完成。使用的設(shè)備Herceptin test只需要一般光學(xué)顯微鏡，F(xiàn)ISH則需要使用熒光顯微鏡。從分子生物學(xué)原理上講FISH檢測的是腫瘤細(xì)胞的DNA，而Herceptin test（免疫化學(xué)法）檢測的是細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)。實(shí)際上真正執(zhí)行基因功能的物質(zhì)是蛋白質(zhì)而不是DNA，這要看HER-2基因是否擴(kuò)增，當(dāng)然以觀察細(xì)胞膜表面HER-2蛋白質(zhì)的量是否增加最為直接。也最為可信。因?yàn)橛袝r(shí)即使DNA有擴(kuò)增其結(jié)果未必能在蛋白質(zhì)曾面表現(xiàn)出來。因?yàn)橛蒁AN有表現(xiàn)到蛋白質(zhì)被制造出來必須經(jīng)過很多程序，中間可能出現(xiàn)很多干擾因素。除此之外，免疫化學(xué)檢測法比較便宜，省時(shí)，可以較普遍的篩選。FISH的優(yōu)點(diǎn)在于使用傳統(tǒng)分子生物學(xué)方法檢測腫瘤組織的DNA。FISH在熒光顯微鏡下可以確認(rèn)出腫瘤所在的位置，以Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe來說，它會(huì)把HER-2基因部位橘色熒光亮點(diǎn)，還將第17對染色體的中心顆粒（centromere）呈現(xiàn)綠色亮點(diǎn)，我們只要對比橘色和綠色亮點(diǎn)的數(shù)目，若橘色點(diǎn)/綠色點(diǎn)大于2，就表示有HER-2擴(kuò)增，正常細(xì)胞橘色點(diǎn)/綠色點(diǎn)數(shù)目比值小于2。FISH同IHC HER-2水平檢測方法相比，IHC檢測的準(zhǔn)確性不如原位雜交（CISH）和原位熒光雜交法（FISH）。就各種檢測方法比較FISH為最好，F(xiàn)ISH檢測的結(jié)果可靠，被喻為HER-2水平檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。 HER-2 免疫組織化學(xué)+2的意思是腫瘤組織在免疫組織化學(xué)染色下著色強(qiáng)度為2價(jià)。多數(shù)認(rèn)為HER-2 +3（3價(jià)）具有臨床意義，可以作為使用Herceptin治療的依據(jù)。her-2 IHC+2則必須加作FISH檢測是否真的有HER-2擴(kuò)增。而HER-2 IHC 0或+1則表示沒有沒有HER-2過表達(dá)，不必再作FISH，也不適合使用Herceptin治療。FISH檢測方法試劑和儀器Vysis提供的材料根據(jù)訂貨該盒內(nèi)含有大約足夠檢測20，50和100人份試劑。限定一份檢測22 x 22mm靶區(qū)。1） LSI HER2/neu黃色光譜（low copy number E. coli vector）/CEP 17 綠光譜DNA探針（E.coli plasmid）Vysis P.N ( product number):30-17060/35-171060Quantity: 200uL/500uL/500uLx2 for the 100 assay kitStorage: -20 in the darkComposition (成分): SpetrumGreen fluorophore-labeled alpha satellite DNA probe for chromosome 17, SpectrumOrange fluophore-labeled DNA probe for the HER-2/neu gen locus, and blocking DNA, pre-denatured in hybridization buffer.2) DAPI Conuterstain Vysis P.N: 30-804840/30-804860/30-804960Quantity:300uL/600uL/1000UlStorage: -20 in the darkComposition: 1000ng/mL DAPI (4,6-diamino-2phenylindole) in phenylenediamine dihydrochloride, glycerol, and buffer.3) N P-40Vysis P.N: 30-804820Quantity:4mL (2 vials)Storage:-20 to 25Composition:N P-404) 20 XSSC saltsVysis P.N:30-805850Quantity:66g for up to 250mLof 20 X SSC solutionStorage:-20 to 25Composition:sodium chloride and sodium citrateNote: Material Safety Data Sheets (MSDS 材料安全數(shù)據(jù)表) for all reagents provided in the kits are available upon request from the Vysis Technical Department.Storage and handling 貯存和處理未開封的Path Vysis 試劑盒-20貯存并避光和潮濕。20 X SSC 鹽和NP-40可以單獨(dú)貯存于室溫。每一種成分包裝上面都標(biāo)明了有效期。同時(shí)也標(biāo)明了打開和未開包裝的貯存條件。試劑盒中的某些成分接觸光、熱或潮濕會(huì)影響試劑的有效期，應(yīng)該避免。不按包裝規(guī)定的條件保存可能會(huì)影響檢測結(jié)果。需要的材料但Vysis公司不提供實(shí)驗(yàn)室試劑 HER-2/ nue探針檢測正常對照（正常信號(hào)率）order No.30-805093 福爾馬林固定，石蠟包埋，培養(yǎng)好的人細(xì)胞株（normal LSI HER-2/nue;CEP 17 ratio）應(yīng)用型顯微鏡載玻片數(shù)量：5片，對照片在15-30干燥劑防潮密封在容器中貯存。HER-2/ nue探針界限對照片（弱擴(kuò)增信號(hào)率）order No.30-805042；福爾馬林固定，石蠟包埋。培養(yǎng)好的人細(xì)胞株（低水平HER-2/ nue擴(kuò)增）應(yīng)用型顯微鏡載玻片數(shù)量：5片，對照片在15-30干燥劑防潮密封在容器中貯存。石蠟預(yù)處理試劑盒（Vysis cat.32-801200）盒內(nèi)包括：預(yù)處理液（NaSCN）數(shù)量：5 X 50mL蛋白酶（胃蛋白酶2500-3000單位/mg）數(shù)量：5 X 25mg蛋白酶緩沖液（NaCl solution, pH 2）數(shù)量：5 X 50Ml緩沖洗液（2 X SSC，pH 7）數(shù)量：2 X 250mL中性緩沖福爾馬林液（4%多聚甲醛PBS配制）Hemo-De ( 血液德)透明劑（Fisher product No.15-182-507A）蘇木精和伊紅（H&E）適當(dāng)?shù)臒晒怙@微鏡浸泡油。室溫貯存超純甲酰胺。從發(fā)貨計(jì)算4保存1個(gè)月（查看生產(chǎn)商推薦的詳細(xì)信息）100%乙醇。室溫貯存濃縮的（12N）鹽酸1N氫氧化鈉純凈水（蒸餾水或去離子水或Milli-Q）。室溫貯存橡膠水泥膠Drierite德里拉特干燥用無水硫酸,商品名和液氮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備預(yù)清潔硅化或正電荷顯微鏡載玻片載玻片加熱器（要求有準(zhǔn)確的溫度數(shù)字顯示）45-5022 mm X 22 mm玻璃蓋玻片可調(diào)容積吸管（1-10 uL）和無菌微量移液管頭聚丙烯微量離心管（0.5-1.5mL）計(jì)時(shí)器切片機(jī)磁力攪拌器漩渦混合器微量離心機(jī)刻度量筒水浴鍋（371，721和801）水?。?0）無蛋白質(zhì)干燥箱（37-56）鉆石筆雜交濕盒鑷子一次性注射器（5 mL）染色缸（6）建議型號(hào)：Wheaton Product No.900620豎式染色缸熒光顯微鏡設(shè)備和推薦的濾光片（見第二部分）pH計(jì)和pH試紙溫度計(jì)帶蓋載玻片盒0.45細(xì)孔過濾設(shè)備顯微鏡設(shè)備和附屬品顯微鏡：觀察原位雜交結(jié)果需要一種磊照明熒光顯微鏡，如果有合適的熒光顯微鏡。應(yīng)該檢查熒光顯微鏡是否能較好的觀察原位雜交樣品。用老式顯微鏡一般DNA染色例如DAPI，碘化丙啶和奎納克林不具備足夠的功能進(jìn)行FISH檢測。顯微鏡常規(guī)清潔和定期調(diào)試應(yīng)該由生產(chǎn)商家的技術(shù)人員完成。注釋：Often a presumed failure of reagents in an in situ assay may actually indicate that a malfunctioning or sub-optimal fluoroscope or incorrect filter set is being used to view a successful hybridization assay.激發(fā)光源：100W 汞燈它的大約壽命200小時(shí)是推薦的激發(fā)光源。汞燈用后應(yīng)該記錄使用小時(shí)數(shù)。超過規(guī)定的時(shí)間之前應(yīng)該更換。確保汞燈適當(dāng)?shù)膽?yīng)用。接物鏡：顯微鏡汞燈100W使用的熒光接物鏡浸泡油數(shù)值孔徑0.75。一個(gè)40X 接物鏡用10X目鏡連接適合掃描。對FISH分析用63X或100X油浸消色差透鏡型接物鏡就可以獲得滿意的結(jié)果。浸泡油：油浸接物鏡使用的浸油，是一種低自發(fā)熒光和專用熒光顯微鏡的配方。濾光片：多帶通熒光顯微鏡濾片裝置最適合用于CEP和LSI DAN 探針試劑盒可以從Vysis 獲得一些顯微鏡濾片型號(hào)。Path Vysion 試劑盒推薦濾片裝置是DAPI/9-Orange 雙帶通，DAPI/Green雙帶通和DAPI/Green/Orange三重帶通。LSI HER-2/nue原位雜交和CEP17探針對它們的靶區(qū)分別標(biāo)記橙色和綠色熒光。其它所有DNA DAPI染色為綠色熒光。工作液的準(zhǔn)備20X SSC（3M氯化鈉，0.3M檸檬酸鈉，pH 5.3）配制20X SSC pH 5.3 加入的順序：66g20X SSC200mL純化水250mL最終量徹底混合，用pH計(jì)室溫下測pH，用濃鹽酸調(diào)pH到5.3。加純水至總量250沒mL。通過0.45um孔徑的過濾設(shè)備過濾。室溫貯存6個(gè)月。變性液（70%甲酰胺/2X SSC，pH 7.0-8.0）配制甲酰胺的順序：49mL甲酰胺7mL20X SSC, pH5.314mL純化水70mL最終量徹底混合，用pH計(jì)室溫下測pH，用玻璃電極（glass electrode 利用薄玻璃膜將兩種溶液隔離而產(chǎn)生電勢差的電極，常用于測量溶液的pH）調(diào)pH至7.0-8.0之間。液體可以保存一周。每次用前檢查pH。貯存于2-8，不用的時(shí)候蓋緊容器的蓋子。乙醇液用100%乙醇和純化水v/v稀釋70%，80%。避免蒸發(fā)或稀釋過量，不用的時(shí)候蓋緊容器的蓋子。配制后可以使用一周。后雜交緩沖洗液（20X SSC/0.3% NP-40）配制順序：100mL20X SSC, pH 5.3847mL純化水3mLNP-401000mL最終量徹底混合，用pH計(jì)室溫下測pH，用1 N氫氧化鈉調(diào)pH至7.0-7.5。加純化水到總量1000mL。通過0.45um孔徑的過濾設(shè)備過濾。使用過的液體當(dāng)日丟棄，未使用過的液體室溫貯存6個(gè)月。注意事項(xiàng)和預(yù)防措施1 Vysis Path Vysion HER-2 DNA Probe kit用于體外診斷使用。2 The PathVysion Kit 僅用于福爾馬林固定石蠟包埋乳腺癌組織；不作為新鮮組織或非乳腺癌組織使用。3 所有生物學(xué)標(biāo)本經(jīng)過防止傳染病傳遞的藥劑處理。盒子里提供的是人細(xì)胞株經(jīng)過10%福爾馬林固定的對照細(xì)胞涂片。因?yàn)槌３２磺宄欠駮?huì)引起傳染，所有人標(biāo)本和對照片是經(jīng)普遍預(yù)防處理。標(biāo)本處理指南從美國疾病控制中心獲得。4 標(biāo)本應(yīng)該避免酸，強(qiáng)堿或過熱，這樣的條件會(huì)破壞DNA引起FISH檢測失敗。5 下面所有步驟對標(biāo)本變性，雜交和檢測可以引起不可接受失敗或錯(cuò)誤的結(jié)果。6 相同組織塊的第10張切片應(yīng)該進(jìn)行H.E染色對靶區(qū)進(jìn)行辨認(rèn)。7 使用其它試劑代替Vysis公司提供的試劑可能對雜交條件產(chǎn)生不利的影響。8 確保標(biāo)記的有效期以盒子上正確貯存說明為基礎(chǔ)，不按貯存說明要求存放可能對檢測結(jié)果不利。9 如果貯存在低溫，20X SSC可以出現(xiàn)結(jié)晶，如果結(jié)晶在室溫下不能再溶解，該液應(yīng)該丟棄。10 如果其它工作液沉淀或渾濁應(yīng)該丟棄，從新配制新工作液。11 該DAPI對比染色含有DAPI（ 4,6-二氨基-2-苯基吲哚）和1,4苯二胺。DAPI是一種可能的誘變劑明確建立在遺傳毒性影響的基礎(chǔ)上。1,4苯二胺被認(rèn)為是一種皮膚致敏劑和一種可能的呼吸致敏劑，避免吸入，攝取或皮膚接觸。參考MSDS詳細(xì)警告。12 熒光暴露在光線下容易被光漂白，限制這種降級(jí)。操作所有含熒光的液體時(shí)要減少光線暴露。所有步驟牽涉到處理雜交的切片。所有（孵育、洗等）步驟不要在光線下應(yīng)該在暗處操作。13 LSI HER-2/neu CEP17 DNA 探針混合物含有甲酰胺，一種致畸因子。避免接觸皮膚和黏膜。14 校準(zhǔn)溫度需要測量液體、水浴鍋和恒溫箱的溫度。15 總要核實(shí)預(yù)處理液，變性液和洗液的溫度，使用前用標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)對科普林缸內(nèi)液體進(jìn)行測量核對溫度。16 所有有危險(xiǎn)的物質(zhì)應(yīng)該按當(dāng)?shù)睾蛧抑笇?dǎo)方針進(jìn)行無害化處理。標(biāo)本處理和載玻片準(zhǔn)備標(biāo)本收集和處理Path Vysion 試劑是為福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品檢測而設(shè)計(jì)的，組織收集應(yīng)該按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)程序執(zhí)行。Path Vysion 檢測對組織的選擇應(yīng)該由病理學(xué)家完成。標(biāo)本避免接觸酸，強(qiáng)堿或非常高的溫度。這種情況會(huì)破壞DNA導(dǎo)致FISH檢測失敗。切片厚度4-6微米，福爾馬林固定，石蠟包埋的組織可以按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟處理和貯存。確保Path Vysion 試劑盒檢測的最佳結(jié)果，對所有標(biāo)本分析這些方法應(yīng)該一致。用于FISH檢測分析組織塊的第10張作H.E染色，以便對靶區(qū)進(jìn)行辨認(rèn)。組織切片應(yīng)該貼在膠包被載玻片的正面，以便在FISH檢測中脫片。Path Vysion 試劑盒有足夠檢測大約20人份的試劑；每份限定22mm X 22mm區(qū)域。較大的組織切片超過22mm X 22mm區(qū)域每份加探針應(yīng)該大于10uL。福爾馬林固定石蠟包埋組織切片準(zhǔn)備使用下列方法進(jìn)行準(zhǔn)備1. 切片4-6微米。2. 切片飄在無蛋白質(zhì)40水中。3. 貼在有機(jī)硅烷膠包被載玻片的正面。4. 讓切片在空氣中干燥。（Start processing ProbeChek control slides here）5. 烤切片56過夜。切片預(yù)處理在進(jìn)行Path Vysion 試劑盒檢測前標(biāo)本需要經(jīng)過固定，切片必須脫蠟。Path Vysion預(yù)處理試劑盒插在包裝中，（Product No. 32-801200）含有詳細(xì)的說明。下面是簡要的步驟說明。切片脫蠟切片浸在Hemo-De 10min，室溫。用新Hemo-De重復(fù)兩次。切片在100%乙醇5min，室溫，重復(fù)。空氣干燥切片或把切片放在45-50載玻片加熱器上。預(yù)處理切片切片浸在0.2N HCI 20 minutes切片浸在純化水中3 minutes切片浸在緩沖洗液中3 minutes切片浸在預(yù)處理液中80 30 minutes切片浸在純化水中1 minutes切片浸在緩沖洗液中5 minutes，重復(fù)蛋白酶處理在載玻片邊緣用紙巾吸干載玻片上過多的緩沖液切片浸在蛋白酶液中37，10 minutes切片浸在緩沖洗液中5 minutes， 重復(fù)干燥切片在45-50載玻片加熱器上2-5 minutes。標(biāo)本固定切片浸在中性緩沖福爾馬林液中，室溫，10 minutes。切片浸在緩沖洗液中5 minutes， 重復(fù)干燥切片在45-50載玻片加熱器上2-5 minutes。繼續(xù)the Path Vysion 檢測擬訂計(jì)劃FISH測試步驟Fluorescence In Situ Hybridization Procedure Summary樣品DNA變性探針液DNA變性和雜交步驟準(zhǔn)備工作應(yīng)該同步進(jìn)行。1 將雜交用的濕盒在37中預(yù)熱（濕盒內(nèi)放有濕紙巾）。2 使用前在室溫下將變性液pH調(diào)到7.0-8.0，把變性液加入玻片染色缸內(nèi)（Coplin jar）而后在721水浴至少30min或變性液達(dá)到721，使用前測量溫度。3 使用鉆石筆尖劃刻標(biāo)記雜交區(qū)域。4 將準(zhǔn)備好的切片放入到達(dá)到721的變性液中（6片/缸）5min。Note: Verify the solution temperature before each u