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文檔簡介
考馬斯亮藍G 250法測定蛋白質含量 實驗目的 了解考馬斯亮藍法測定蛋白質的原理掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的操作步驟 實驗原理 考馬斯亮藍G250在酸性的溶液中游離狀態(tài)呈紅褐色 與蛋白質結合后呈藍色 其最大吸收波長由465nm轉變?yōu)?95nm 在一定的蛋白質濃度范圍內 595nm處的光密度值與蛋白質濃度成反比 可用比色法進行蛋白質定量測定 儀器和試劑 1 儀器 分析天平 吸管0 1ml 1 1ml 2 5ml 1 試管10個 722型分光光度計 容量瓶100ml 1000ml各一個 2 試劑 1 0 9 NaCl溶液 2 標準蛋白質溶液 稱取10mg牛血清白蛋白 溶于蒸餾水并定容至100ml 制成0 1mg ml的原液 3 考馬斯亮藍G 250 0 01 染液 稱取0 1g考馬斯亮藍G 250 溶于50ml90 乙醇中 加入85 m v 的磷酸100ml 最后用蒸餾水定容至1000ml 此溶液不宜久存 在常溫中可放置1 2個月 4 樣品液 取牛血清白蛋白0 1mg ml的溶液 用0 9 NaCl溶液稀釋至一定濃度 操作步驟 1 0 100 g mL標準曲線的制作 取6支試管 編號后 按下表加入試劑 混勻 室溫靜置5min后 以管1為空白對照 在595nm下比色測定 以標準蛋白質含量 g 為橫坐標 吸光度為縱坐標 繪出標準曲線 2 樣品中蛋白質含量的測定另取兩支干凈的試管 做一重復 加入合適濃度的待測樣品 使其測定值在標準曲線的范圍內 測定方法同上 由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量 計算 樣品的蛋白質含量 g g鮮重 查得的蛋白質含量 g 樣品鮮重 g 注意事項 1 如果要求嚴格 最好在試劑加入后的5 20min內測定光吸收 因為這段時間內顏色是最穩(wěn)定的 2 測定中 蛋白 染料復合物會有少部分吸附于比色杯壁上 不可使用石英比色皿 因不易洗去染色 可用塑料或玻璃比色皿 使用后立即用少量95 的乙醇蕩洗 以洗去染色 塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡 思考題 1 說出你所知道的幾種蛋白質定量測定的方法 并與考馬斯亮藍染色法相比較各有何優(yōu)缺點 2 根據下列所給的條件和要求 選擇一種或幾種常用的方法測定蛋白質的濃度 1 樣品不易溶解 但要求結果較
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