基因克隆與表達ppt課件

蛋白原核表達 衛(wèi)文強2015 12 目的基因 T表達載體酶切 膠回收 連接轉化到克隆用細胞 Top10 提質粒 酶切驗證轉化到表達用細胞 BL21 DE3 誘導表達SDS PAGE DNA中的雜質如蛋白質 酚 氯仿 乙醇 SDS EDTA等都會影響酶的活性 1 DNA的純度 影響限制性內切酶活性的因素 2 DNA的甲基化程度 dam甲基化酶 修飾GATC中的A dcm甲基化酶 修飾CCA TGG的C 3 溫度 不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同 大多數(shù)是37oC 少數(shù)要求40 65oC 是影響限制酶活性的重要因素 4 緩沖液 Buffer 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液 MgCl2 NaCl KCl 提供Mg2 和離子強度 Tris HCl 維持pH 二硫蘇糖醇 DTT 保持酶穩(wěn)定性 牛血清白蛋白BSA等 有助于酶的穩(wěn)定 巰基乙醇 保持酶的穩(wěn)定性 防止酶失活 用時在冰上操作 取酶用干燥 滅菌 新的槍頭酶用量不能超過酶切總體積的10 多種酶進行酶切時 先低鹽后高鹽緩沖液 關心小貼士告訴你 使用時注意事項 連接 轉化與重組子鑒定 1 連接 1 必須是兩條雙鏈DNA 2 DNA3 端有游離的 OH 5 端有一個磷酸基團 P 3 需要能量 動物或噬菌體中 ATP大腸桿菌中 NAD 2 連接條件 ATP 反復凍熔 ATP活性降低 ATP溶解度不高 連接緩沖液宜分裝 單價離子 150 200mMNaCl 提高連接效果 PEG 5 以下可以提高連接效率 連接效果最好在37 但形成的互補不穩(wěn)定 最佳連接溫度 12 16 較好的連接效果 互補又較穩(wěn)定 2 連接溫度 3 反應液中的成分 目的或作用 4 插入片段與載體的濃度比例 載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1 3左右 甚至1 10或更高 增加插入片段與載體的接觸機會 減少載體自我連接的現(xiàn)象 化學法 CaCl2法 轉化原理 是Ca2 與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構 后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用 使細胞膜出現(xiàn)空隙 質?；駾NA重組分子便可進入細胞內 感受態(tài)細胞 2 轉化 影響轉化率的主要影響因素 載體本身的性質及其空間構象 超螺旋構象轉化率最高 插入片段的大小 插入片段越大 轉化效率越低 受體細胞的類型及預處理 轉化方法 電擊法高于化學法 限制性酶切圖譜法 3 轉化子的篩選和鑒定 質粒DNA的提取 質粒具有自主復制和轉錄能力 能在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù) 并表達所攜帶的遺傳信息 質粒 Plasmid 是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子 大小從1 200kb不等 為雙鏈 閉環(huán)的DNA分子 并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細胞中 質粒DNA提取方法 堿裂解法 煮沸法 SDS法等 堿裂解法原理 在堿性條件下 雙連DNA氫鍵斷裂 結構破壞變性 環(huán)狀超螺旋質粒不充分變性 在中性條件下變性質?；謴驮瓉順嬓?而線性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經(jīng)離心除去 抽提出質粒的構型 1 超螺旋質粒DNA 在提取質粒過程中 超螺旋DNA占大部分 2 開環(huán)質粒DNA 如果質粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂 分子就能旋轉而消除鏈的張力 形成松馳型的環(huán)狀分子 稱開環(huán)DNA 3 線狀質粒DNA 如果質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂 則形成線狀DNA 抽提出的質粒三種構型電泳結果 凝膠電泳技術 電泳目的 對核酸分子進行分離和檢測 凝膠分辨DNA的能力 凝膠濃度 濃度大 篩孔小 適合小分子電泳 濃度小 篩孔大 適合大分子電泳 凝膠濃度的選擇 取決于待檢測的DNA的大小 原來如此 電泳緩沖液 pH值 偏堿性 帶負電荷 離子濃度 離子濃度高 電流大 發(fā)熱快 膠溶解 種類 TAE Tris EDTA 醋酸 電流大 易產(chǎn)生離子富集TBE Tris EDTA 硼酸 緩沖能力最強TPE Tris EDTA 磷酸 緩沖能力低TNE Tris EDTA 醋酸鈉 pET表達載體 pET表達載體的啟動子是T7噬菌體基因10啟動子 T7啟動子 需要T7RNA聚合酶才能轉錄 T7RNA聚合酶轉錄機制十分有效并具有選擇性 充分誘導時 幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白 在非誘導條件下 幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉錄 T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動子控制 DE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上 T7表達系統(tǒng)轉錄調控的機理化學誘導型噬菌體DE3是l噬菌體的衍生株 一段含有l(wèi)acI lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int基因中用噬菌體DE3的溶源菌作為表達載體的宿主菌 調控方式為化學誘導型 類似于Lac表達系統(tǒng) T7RNA聚合酶基因 lac啟動子 E Coli DE3 IPTG誘導 BL21 lon ompTBL21 DE3 T7polymeraseRosetta optimalcodonsOrigami thioredoxinreductase trxB glutathionereductase gor Rosetta gamiOrigamiB IPTGconcentrationdependent 菌株種類 基本原理 SDS PAGE技術是根據(jù)SDS能使蛋白質變性解聚成肽鏈并與肽鏈側鏈以一定比例結合成SDS 肽鏈復合體 從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷 SDS帶負電 并消除了蛋白質分子間的形狀差異 再結合PAGE技術 根據(jù)分子的形狀 電荷 分子量綜合差異來分離不同分子的技術 來分離不同分子量蛋白質或測定定蛋白質分子量的實驗技術 基本步驟 制備分離膠制備濃縮膠上樣并電泳凝膠板剝離與染色脫色結果分析 加入分離膠溶液pH8 8 制備分離膠 封水的目的是使分離膠上表面平直 并排除氣泡 凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面 分離膠pH8 8 制備濃縮膠 濃縮膠pH6 8 分離膠pH8 8 上樣及電泳 開始電壓恒定在80V 當進入分離膠后改為120V 溴酚藍距凝膠邊緣約5mm時 停止電泳 凝膠板剝離與染色 電泳結束后 撬開玻璃板 將凝膠做好標記后放在大培養(yǎng)皿內 加入染色液 染色1 2小時左右 脫色 染色后的凝膠用蒸餾水漂洗數(shù)次 再用脫色液脫色 直到