細(xì)胞培養(yǎng)及材料細(xì)胞毒性檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)cellculture 前言細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞管理及保藏細(xì)胞毒性檢測(cè) 主要內(nèi)容 WilhelmRoux 1850 1924 1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng) 材料是雞胚神經(jīng)板 采用生理鹽水為培養(yǎng)液 并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語 1 前言 AlexisCarrelFranceRockefellerInstituteforMedicalResearchNewYork NY USAb 1873d 1944 1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法 用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng) 他建立的雞胚胎成纖維細(xì)胞持續(xù)了34年之久 1912 1946 器官培養(yǎng) Organculture 將活體中整個(gè)器官或一部分器官取出 置于體外生存 生長(zhǎng)并同時(shí)保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征 組織培養(yǎng) Tissueculture 把活體的一小片組織 O 5 1立方毫米 置于底物上孵育 細(xì)胞自其周圍移出并生長(zhǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) cellculture 把提取的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞懸液 后進(jìn)行培養(yǎng) 增殖 2 基本概念 腫瘤 胚胎 成體 粗切 消化 細(xì)切 修切 細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng) 器官培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) 活細(xì)胞便于觀察檢測(cè)條件可控均一性便于人工篩選 培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞的差異 失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài) 趨向單一性分化減弱可能獲得不死性 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)類型 貼壁型 動(dòng)物的正常細(xì)胞懸浮型 血液淋巴細(xì)胞 腫瘤細(xì)胞 植物細(xì)胞固定化培養(yǎng) 來源 由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如 真正的成纖維細(xì)胞心肌 平滑肌 成骨細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài) 似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)胞體梭形或不規(guī)則三角形胞質(zhì)向外伸出2 3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起中有卵圓形核 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 生長(zhǎng)特點(diǎn) 排列成放射狀 漩渦狀并不緊靠連成片 細(xì)胞 細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng) 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程 原代細(xì)胞 從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞原代培養(yǎng) 將從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代培養(yǎng) 從原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)傳代細(xì)胞 在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)的工作原則 無菌無毒 生物相容性清潔的環(huán)境品質(zhì)良好的細(xì)胞來源 培養(yǎng)基配制使用高純度藥品和去離子水有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法培養(yǎng)用的液體極多 應(yīng)由專人負(fù)責(zé) 配制濃度準(zhǔn)確 所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱 濃度 消毒與否和制備日期等一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn) 避免雜亂無章 其中尤其重要的是 培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開 已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放 3 細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 無菌條件 凈化工作室 風(fēng)淋室 傳遞窗 高效過濾器 潔凈層流罩 生物安全柜 超凈工作臺(tái) 紫外燈 電熱干燥箱 濾器 高壓滅菌器 抗生素細(xì)胞生長(zhǎng)條件 培養(yǎng)板 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱 培養(yǎng)基 血清細(xì)胞檢測(cè)條件 倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器 高速離心機(jī) 移液器細(xì)胞保存條件 液氮罐 超低溫冰箱 常用儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)高壓蒸汽滅菌器過濾除菌裝置倒置顯微鏡水純化裝置恒溫培養(yǎng)箱電熱干燥箱離心機(jī) 天平 水浴 搖床液氮罐冰箱 4 20 80 細(xì)胞培養(yǎng)器材 移液器移液管吸管培養(yǎng)瓶 25cm2 75cm2 150cm2培養(yǎng)皿 30 60 120毫米多孔培養(yǎng)板 4 6 24 96孔離心管凍存管 基礎(chǔ)培養(yǎng)基80 95 血清5 20 青 鏈霉素各100U ml 完全培養(yǎng)基的組成 天然培養(yǎng)基 血清血漿組織提取液 如雞胚和牛胚浸液 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量 用人工方法模擬合成的 包括四大類物質(zhì) 無機(jī)鹽 氨基酸 維生素 碳水化合物目前常用培養(yǎng)基 RPMI 1640 DMEM M199 MEM 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存 要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖 還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基 如血清 常用血清胎牛血清 新生牛血清 小牛血清 兔血清 馬血清等優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)透明 淡黃色 無沉淀物 無細(xì)菌 支原體 病毒污染 血清的滅活 消除補(bǔ)體活性 56 30分鐘 血清的消毒 過濾除菌 血清的使用 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液 水 新鮮的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成作用 維持滲透壓 緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度常用的緩沖液 生理鹽水PBSHanks液 D Hank s常用于配制胰酶溶液 抗生素溶液 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用 俗稱 雙抗溶液 配制具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成 青霉素是80萬U 瓶 用注射器加4ml滅菌雙蒸水 鏈霉素是100萬U 瓶 加5ml滅菌雙蒸水 即每毫升各為20萬U 使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中 使青 鏈霉素的濃度最終為100U ml 慶大霉素 使用終濃度為100U ml 廣譜 穩(wěn)定 主要作用 水解與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵 除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白 使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞分離 常用濃度 0 25 用無Ca2 Mg2 的PBS緩沖液或D Hank s配制 用濾器過濾除菌 消化時(shí)間 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用 胰蛋白酶溶液 消化液 胰蛋白酶溶液 EDTA溶液 膠原酶溶液 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞 從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型 還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞 4 細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 粘著 粘附 attachment 鋪展 spreading 得到細(xì)胞 1 取材 切割 組織塊培養(yǎng)法 消化培養(yǎng)法 2 直接購(gòu)買 培養(yǎng) 原代培養(yǎng) 傳代 體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代 以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞 并維持細(xì)胞種的延續(xù) 培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后 由于密度過大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭 將培養(yǎng)的細(xì)胞分散 從容器中取出 以1 2或l 3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng) 即為傳代培養(yǎng) 棄去舊培養(yǎng)液 清洗 加入消化液 吸棄消化液 加入培養(yǎng)液 吹打分散細(xì)胞 分裝稀釋細(xì)胞 補(bǔ)加培養(yǎng)液 繼續(xù)培養(yǎng) 接種數(shù)量為5 104 8 105個(gè) ml 傳代密度太低 細(xì)胞容易死亡 表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期 培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色 表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng) 如果是單層貼壁的細(xì)胞 等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面 即可進(jìn)行傳代 傳代注意事項(xiàng) 游離期懸浮 胞質(zhì)回縮 全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形 吸附期貼附底物 一般24小時(shí)內(nèi)貼壁 潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng) 基本無增殖 細(xì)胞株潛伏期一般為6 24小時(shí) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng) 活力最佳 最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究 停止期 平臺(tái)期 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后 細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制 接觸抑制 密度依賴性 細(xì)胞傳代的增殖生長(zhǎng)過程 細(xì)胞觀察 肉眼觀察 培養(yǎng)液的顏色和透明度顯微鏡觀察生長(zhǎng)良好的細(xì)胞 細(xì)胞透明度大 折光性強(qiáng) 輪廓不清生長(zhǎng)狀態(tài)不良的細(xì)胞 細(xì)胞輪廓增強(qiáng) 細(xì)胞折光性變?nèi)?胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡 脂滴和其他顆粒狀物質(zhì) 細(xì)胞之間空隙增大 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則 甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn) 產(chǎn)生圓縮脫落 有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物 細(xì)胞計(jì)數(shù) 每毫升細(xì)胞數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 細(xì)胞生長(zhǎng)的指標(biāo) 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線貼壁率有絲分裂指數(shù) MI 分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的百分比細(xì)胞群體倍增時(shí)間四唑鹽 MTT 比色法標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷 3H TdR 摻入量 細(xì)胞活力測(cè)定 細(xì)胞活力 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比臺(tái)盼藍(lán)法四唑鹽 MTT 比色法熒光素雙乙酸酯法 FDA 四唑鹽 MTT 比色法MTT比色法的原理 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢 formazan 并沉淀在細(xì)胞中 而死細(xì)胞沒有這種功能 二甲亞砜 DMSO 能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物 溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值 用酶標(biāo)儀測(cè)定A值 細(xì)胞培養(yǎng)的其他指標(biāo) 細(xì)胞大小 顯微測(cè)微計(jì)法細(xì)胞重量 稱重法鮮重干重 細(xì)胞固定與染色 細(xì)胞固定蘇木精 伊紅染色Giemsa染色Feulgen染色考馬斯藍(lán)染色免疫法細(xì)胞核染色 Hoechst DAPI 細(xì)胞污染 混濁 pH異常改變 細(xì)胞外形模糊 漂浮的集落細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡化學(xué)物質(zhì)的污染非同種細(xì)胞污染微生物污染 細(xì)菌 真菌 支原體 病毒 5 細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè) 細(xì)菌污染 培養(yǎng)液變黃 出現(xiàn)渾濁鏡下可見圓球狀顆粒漂浮預(yù)防和處理 青霉素 鏈霉素 真菌污染 培養(yǎng)液一般不渾濁白色或黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)基表面光鏡觀察到菌絲預(yù)防和處理 抗真菌劑 支原體污染 可透過濾膜無細(xì)胞壁 細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液仍清亮但變黃 細(xì)胞生長(zhǎng)變緩 部分細(xì)胞發(fā)生脫落 細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn) 污染的控制 預(yù)防重新培養(yǎng)鑒別清除 抗生素 加溫 支原體特異性血清 共培養(yǎng)法 重新克隆法 動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法防止交叉污染 6 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 慢凍快融低溫保護(hù)劑 10 的甘油或二甲亞砜DMSO 細(xì)胞深低溫保存的基本原理 80 以下時(shí) 細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止 即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài) 故可以長(zhǎng)期保存 慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下 可以產(chǎn)生以下變化 細(xì)胞器脫水 細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高 并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 如果緩慢冷凍 可使細(xì)胞逐步脫水 細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶 相反 冰晶很大 大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜 細(xì)胞器的損傷和破裂 復(fù)蘇過程應(yīng)快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重結(jié)晶 7 細(xì)胞的管理及保藏 對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱 細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定 大多采用有一定意義縮寫字母或代號(hào)表示 但不論什么形式 均不宜太長(zhǎng) 以便記憶和了解 HeLa 為供體患者的姓名 HenriettaLacks 來源于宮頸癌 CHO 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 ChineseHamsterOvary NIH 3T3 美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所 NationalInstituteofHealth 建立 每3天傳代一次 每次接種3 106細(xì)胞 毫升 細(xì)胞庫(kù)的建立 主細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù) 原始細(xì)胞庫(kù) 主細(xì)胞庫(kù) 生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù) 細(xì)胞保存機(jī)構(gòu) ATCC AmericanTypeCultureCollection www atcc orgECACC EuropeanCollectionofCellCultures www hpacultures org uk中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù) 8 細(xì)胞毒性檢測(cè) 參照GB T16886 5 2003 或ISO10993 5 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分 細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法規(guī)定的方法進(jìn)行檢測(cè) 樣品準(zhǔn)備 輻照滅菌將待檢材料在相應(yīng)條件下浸提 不含血清的培養(yǎng)基中在37 環(huán)境下浸提24h 細(xì)胞計(jì)數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板 置CO2培養(yǎng)箱37 培養(yǎng)24h后 棄去原培養(yǎng)液 空白對(duì)照組加入新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液 供試品加入樣品浸提液 加血清 置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 至少24h 于設(shè)定培養(yǎng)時(shí)間后置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 每孔加入20 L質(zhì)量濃度為5g L的MTT溶液 繼