細胞轉染試劑產品銷售專員培訓資料PPT課件

掀起Polyplus轉染風暴 產品專員培訓 J Polyplus transfection 轉染方法介紹 顯微注射法電穿孔法 Amaxa Biolistic顆粒傳遞法 基因槍粒子轟擊法 磷酸鈣法陽離子脂質體法 Invitrogen Roche Qiagen 陽離子聚合物 Sunma梭華 凱基 polyplus 物理方法 化學方法 病毒介導法 轉染的應用 基因組功能研究 基因表達調控 蛋白功能 信號轉導和藥物篩選研究建立細胞系 轉基因細胞模型 永生性細胞株建立轉基因動物模型基因治療研究和應用蛋白功能和定位研究重組蛋白生產及蛋白藥物研究 Whydoweneedtransfectionreagent 細胞轉染難易比較 Adherent SuspensionProblem E g MembraneTHP1 Jurkat Fastdividingcell nondividingcellProblem E g AccesstothenucleusNeurons Cellline PrimarycellProblem E g MoresensitiveEpithelialprimarycells 體外轉染 PolyPlus transfection是法國一家專門致力于研發(fā)和銷售轉染試劑的生物技術公司 PolyPlus transfection公司簡介 PolyPlus transfection提供體內和體外轉染產品 包括基因 寡核苷酸 siRNA及蛋白轉染產品 可進行瞬時和穩(wěn)定的轉染及重組蛋白質制備 InVitro InVivo siRNAtransfection StandardtransfectionINTERFERin jetSI ENDOTraffickingandvisualizationjetSI FluojetSI ENDO Fluo 產品介紹 DNAtransfection Standardtransfectioninvivo jetPEI Ligand conjugatedreagentsinvivo jetPEI Galinvivo jetPEI ManTraffickingandvisualizationinvivo jetPEI Fluoinvivo jetPEI biotin DNAtransfection Invitro Invivo StandardtransfectionjetPEI Cell specifictransfectionjetPEI GaljetPEI MacrophagejetPEI HUVECjetPEI RGDTraffickingandvisualizationjetPEI FluojetPEI biotin SyntheticmediumtransfectionFecturin Proteindelivery ProteinandantibodyPULSin invivo jetPEI MousebraininjectionjetSI 10mM siRNAtransfection 產品系列 Protein antibody轉染 PULSinSiRNA體外轉染 INTERFERinDNA SiRNA體內轉染 invivojetPEIDNA體外轉染 invitrojetPEI 產品系列一 Protein antibody轉染 PULSin 蛋白轉染 Protein antibody轉染 應用 細胞內定位研究蛋白水平的干擾研究抗體功能封閉的研究疾病治療的研究替代免疫細胞化學在活細胞內檢測 蛋白轉染 protein轉染難題 MassChargePurityStability3DstructureRelease Activity xkDapI xx hoursordaysGlobular random well definedstructureFreeproteinincytoplasm DNAandRNA anionicpolymers Protein morecomplexmolecules 蛋白轉染 技術原理 PULSin cationicamphiphilic basedformulation 蛋白轉染 操作步驟 蛋白轉染 R phycoerythrin NIH 3T3cells Conditions Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy16hourspost delivery pI 5 5MW 240kDa PULSin轉染蛋白質 1 gR PE 4 lPULSin Diffusefluorescence EfficientdeliveryofproteinwithPULSin 蛋白轉染 PULSin 轉染單抗 HeLacellsanti NPC AF 488 1 lAb4 lPULSin Conditions Livingcellswereanalyzedbyfluorescencemicroscopy8hourspost delivery Localizedfluorescencearoundnuclearmembrane EfficientdeliveryoffunctionalAb 抗體轉染 PULSin 轉染多抗 HeLacellsanti giantin AF 488 0 5 lAb4 lPULSin Conditions Livingcellswereanalyzedbyconfocalmicroscopy17hourspost delivery PlasmamembraneswerestainedwithConcanavalinA rhodamine EfficientdeliveryoffunctionalAb 抗體轉染 PULSin 轉染多肽 多肽轉染 HeLacells Pep A StreptococcusTPEBepitope 16aa lissamine rhodaminederivative EfficientdeliveryofPeptides PULSin 已轉染的不同細胞類型 R PE 1 g PULSin 4 l Deliverytoawidevarietyofcells 蛋白轉染 PULSin 已轉染的細胞及轉染效率 蛋白轉染 R phycoerythrin R phycoerythrin R phycoerythrin PULSin 蛋白 抗體 多肽列表 蛋白轉染 優(yōu)勢 新新技術 活細胞中進行Protein Ab轉染高轉染效率無細胞毒性即用型溶液操作簡單 PULSin 優(yōu)勢 蛋白轉染 PULSin 的競爭對手 蛋白轉染 Chariot ActiveMotif BioPorter GTS ProteoJuice Merck 產品系列二 體外SiRNA轉染 INTERFERin siRNA轉染 選擇 設計 合成siRNA雙鏈化學合成siRNA質粒表達siRNA轉染siRNA到靶細胞瞬時表達 化學合成siRNA 質粒表達siRNA穩(wěn)定表達 質粒表達siRNA分析檢測RNA干擾作用蛋白水平 WB IF FCmRNA水平 實時定量RT PCR northernblotting siRNA基因沉默實驗設計 iRNA介導基因沉默機制 siRNA siRNAexpressionplasmid CleavagebyDicer siRNAs siRNAassociatewithRISC CleavageofmRNAbyRISC dsRNA DicercleavageofdsRNA HairpinsiRNA Cellmembrane Nuclearmembrane Protein X INTERFERin jetPEI siRNA轉染 實驗操作 siRNA 1nM inserum freemedium 1 AddINTERFERin Vortexandincubate10minatr t 3 1 2 3 4 Addtowellcontainingcellsincompletemedium Incubatefor48hoursat37 C 5 6 Genesilencingassay 6 5 4 2 Protocolforcellsin24 wellplate INTERFERin siRNA轉染 反向操作 HTS操作 Standartprotocol Reverseprotocol Platecells24hpriortotransfection DilutesiRNAs AddINTERFERin VortexIncubate10min Distributeintowells DistributesiRNAsoruselibraries AddINTERFERin MixIncubate10min Addcells 96 wellplate Day1 Day2 Day1 Day3 Plate Transfect Assay Plateandtransfect Day4 Assay siRNA轉染 反向轉染基因沉默效率 A549 GL3LucLuciferase 96 wellplate 反向轉染仍能得到極高的基因沉默效率 siRNA轉染 siRNAdeliverywithINTERFERin CaSkicells 24 wellplate LaminA CImmunofluorescenceassay 1nMsiRNA siRNA轉染 基因沉默效率 基因沉默效率 GreatsilencingdowntopicomolarsiRNAconcentration A549 GL3Luccells 24 wellplate Luciferase 70 92 siRNA轉染 細胞毒性 A549 GL3Luc 24 wellplate 1nMsiRNA NocellulartoxicityobservedwithINTERFERin L1 INTERFERin L2 siRNA轉染 成功轉染的細胞系 SilencingefficiencywithINTERFERin invariouscelllines siRNA轉染 原代細胞的高效沉默 24 wellplateGAPDH 甘油醛 3 磷酸脫氫酶 BranchedDNAassay 96 人原代肝實質細胞 人原代纖維原細胞 82 siRNA轉染 INTERFERin優(yōu)勢 低濃度siRNA 甚至pmol級別 就能達到高效的基因沉默在很多細胞系中 基因沉默效率可達到90 以上在原代細胞中也能達到有效的基因沉默效率無細胞毒性不受血清和抗生素的影響操作簡單價格便宜在反向操作轉染中的效率高 siRNA轉染 siRNA轉染競爭對手 Lipofectamine2000 Invitrogen Oligofectamine Invitrogen HiPerFect Qiagen SiLentFect BioRad InvitrogenisthelargestsiRNAtransfectionmarketQiagenisadangerousoutsiderwithHiPerFect siRNA轉染 INTERFERinvsLipofectamine2000 INTERFERinvsOligofectamine INTERFERinvsHiPerFect SiLentFect INTERFERin 與HiPerFect SiLentFect基因沉默效率 A549 GL3Luc 24 wellplate Luciferase INTERFERin 與HiPerFect SiLentFect細胞毒性 A549 GL3Luc 24 wellplate 1nMsiRNA NocellulartoxicityobservedwithINTERFERin HiPerFect INTERFERin SiLentFect 體內DNA siRNA轉染 invivojetPEI 產品系列三 體內轉染 invivojetPEIvsViruses invivojetPEI easytobeusednotimmunogenicnottoxiccandeliveredoligonucleotidesuptoverylargeDNA butalsosiRNA 體內轉染 體內轉染 invivojetPEIvsViruses Differentroutes Variousanimals Intravenous靜脈Intratumoral瘤內Intracerebral腦室Intraperitonal腹膜Intratracheal氣管灌注Instillation 吸入 MouseRatDuckGuineapigMonkey 體內轉染的路徑和動物 towardsHumanapplication 體內轉染 體內轉染的基因表達分布情況 O Freund 活小鼠體內熒光素酶表達的熒光檢測圖象 用含50 gpCMVluc和invivo jetPEI復合物的400 l5 葡萄糖溶液尾部注射Balb Cmice Liver30000Tumor2000 KidneyL300000 LungR20000000 KidneyR115000 OvaryL210000 LungL16000000 OvaryR150000 CourtesyJL CollandO Freund invivo jetPEI體內轉染 體內轉染 InRats H19 DTA H19 白喉毒素A基因 質粒與invivo jetPEI復合物轉入大鼠膀胱 NBT IIcells50 gDNAatD 4 D 8D 11ratsweresacrified Ohana P etal GeneTherMolBiol 2004 8 181 192 DecreaseinbladderweightInhibitionoftumorgrowth invivo jetPEI轉染對膀胱癌的治療 體內轉染 InHuman H19 DTAplasmid invivo jetPEI 復合物轉染對人膀胱癌的治療 Ohana P etal GeneTherMolBiol 2004 8 181 192 D Video cystoscopyperformedbeforethetreatmentandthreeweeksafterthecompletionofthe6thtreatment showingalargenecroticareareplacingthetumorregion E Treatmentshows 75 tumorregression invivo jetPEI轉染對膀胱癌的治療 體內轉染 活體小鼠尾靜脈注射 24小時后的熒光檢測圖 24hourslater theluciferasegeneexpressionwasmonitoredbybioluminescentimagingoflivemiceusingacooledCCDcamera DNAalone GL2 Luc DNA GL2 Luc GL2 Luc siRNA 10 g DNA GL2 Luc GL3 Luc siRNA 10 g Coll Freund Erbacher invivo jetPEI DNA siRNA共轉染 siRNAandpCMVLuc與invivo jetPEI復合物轉染對熒光素酶肺部表達起明顯的抑制作用 體內轉染 Urban kleinetal GeneTherapy 1 6 2004 C erb2 neu HER 2 receptor invivo jetPEI 體內基因沉默 HER 2downregulationTumorgrowthinhibitionduring18days i p inathymicnudemiceSubcutaneoustumorxenograftsSKOV 3 ovariancarcinomacell A NakedHER 2specificsiRNA 0 6nmole B HER 2siRNA PEIpolyplexes 體內轉染 產品系列四 DNAinvitrotransfection invitrojetPEI 體外DNA轉染 DNA轉染過程 體外DNA轉染 提取質粒DNA或寡核苷酸選擇和培養(yǎng)細胞系轉染瞬時轉染穩(wěn)定轉染 抗性篩選檢測 外源基因細胞內表達的實驗流程 DNA轉染試劑 體外DNA轉染 體外DNA轉染 DNA jetPEI Cationiccomplexes nucleus ProtonSponge cytoplasm Endocytosis invitroDNAdelivery 體外DNA轉染 numberofnitrogenresiduesofjetPEI numberofDNAphosphates ComplexesFormation 2 lofjetPEIfor1 gofDNAatN P 5 InvitroDNAdelivery jetPEI 實驗操作 serum 2 lofjetPEIfor1 gofDNA 1mlofjetPEI 500transfectionsin24 wellplatesor 2500transfectionsin96 wellplates 體外DNA轉染 HeLacells 1 gofpCMVLuc N P5 ComplexesFormation Effectofincubationtime 體外DNA轉染 HeLa HEK293 NIH3T3 galactosidase BHK N P 3 N P 5 control pCMVLacZ Reproductibility Cellstransfectedin24 wellplateswithjetPEI N P 5 witha galactosidase expressingplasmid pCMVLacZ ExpressionwasvisualizedbyX galstainingafter24h jetPEI 轉染效率 體外DNA轉染 細胞特異性jetPEI轉染產品 jetPEI Macrophage 巨噬細胞 jetPEI Mannose Mannosereceptor MacrophagesjetPEI Hepatocyte 肝實質細胞 jetPEI G