UPLC法測(cè)定生長抑素原料藥的含量.doc

此文檔收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除超高效液相色譜法測(cè)定生長抑素原料藥的含量摘 要： 建立快速，準(zhǔn)確，靈敏的測(cè)定生長抑素原料藥的方法。方法 采用沃特世ACQUITY UPLC超高液相色譜系統(tǒng)，以磷酸（取磷酸11Ml，加水900 mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000）為流動(dòng)相，（A）乙腈 （B）梯度洗脫，流速：0.3ml/min；檢測(cè)波長為215nm; 柱溫45；進(jìn)樣體積2L。結(jié)果 生長抑素在0.0051492mg/ml0.12873mg /ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2 = 0.9993），平均回收率（n=9）為99.1%。該檢測(cè)快速，準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，為生長抑素原料藥的質(zhì)量控制提供了一種快速準(zhǔn)確的方法。關(guān)鍵詞：超高效液相色譜 生長抑素原料藥 生長抑素（Somatostatin）主要用于嚴(yán)重急性食道靜脈曲張出血、急性胃或十二指腸潰瘍出血、并發(fā)性急性糜爛性胃炎或出血性胃炎、胰、膽和腸瘺的輔助治療，胰腺手術(shù)后并發(fā)癥的預(yù)防和治療，糖尿病酮癥酸中毒的輔助治療1-3。超高效液相色譜法是一個(gè)新興的領(lǐng)域，Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)也出現(xiàn)不久，目前已發(fā)表的應(yīng)用資料還很不足。與傳統(tǒng)的HPLC相比，超高效液相色譜法的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍4。目前，UPLC多應(yīng)用于代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域，在天然產(chǎn)物的分析方面運(yùn)用也逐漸興起，因?yàn)樵谶@些領(lǐng)域深入研究需要更高的分析精度。使用超高效液相色譜法對(duì)天然產(chǎn)物分析，特別是藥物分析研究領(lǐng)域的發(fā)展將是一個(gè)極大的促進(jìn)5。本實(shí)驗(yàn)選擇采用超高效液相色譜法（UPLC）進(jìn)行生長抑素原料藥含量的測(cè)定，為提升生長抑素原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供方法依據(jù)。2 材料與方法2.1材料2.1.1儀器沃特世ACQUITY UPLC超高液相色譜系統(tǒng)，配置ACQUITY PDA檢測(cè)器及Empower2色譜管理軟件（Mitford，Boston，MA,USA），十萬分之一電子天平（型號(hào)： XP 205），超純水制備儀（型號(hào)：arium 611UV），pH計(jì)（型號(hào)：PHS-3C）2.1.2 試劑 乙腈為色譜純（上海星可生化有限公司，批號(hào)：200912112），磷酸為分析純（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：20070123），三乙胺為分析純（東光華化學(xué)廠有限公司，批號(hào)：220081010），生長抑素原料藥對(duì)照品（深圳市翰宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20090101 含量:8.3% ），生長抑素原料藥樣品（深圳市翰宇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20090801）。2.2 方法色譜條件，美國沃特世ACQUITY 超高效液相色譜法系統(tǒng)，配置ACQUITY PDA檢測(cè)器，色譜柱：ACQUITY BEN C18(2.1mm50mm.1.7m)流動(dòng)相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900 mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000），流動(dòng)相B:乙腈，進(jìn)樣體積：2L，流速：0.35mL/min，檢測(cè)波長：215nm，柱溫：45。 洗脫程序：見表1表1 梯度洗脫程序時(shí)間（Min）流動(dòng)相A()流動(dòng)相B()07.68.48.9796060792140402111.07921圖1 生長抑素的UPLC色譜圖3結(jié)果3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線3 結(jié)果3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線取生長抑素原料藥對(duì)照品12.873mg(精密稱定，含量88.3%)，置50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取0.2、 0.4、 1.0、 2.0、 3.0、 5.0mL 轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，分別制成濃度為0.0051492 0.0102984 0.025746 0.051492 0.077238 0.12873mg/mL的對(duì)照品溶液。用上述超高效液相色譜法色譜條件進(jìn)行測(cè)定，考察線性關(guān)系。結(jié)果顯示，UPLC的回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為y = 2E+07x-36684, R2 = 0.9993，線性良好。見表2表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果y = 2E+07x - 36684R2 = 0.99930500000100000015000002000000250000000.050.10.15系列1線性 (系列1)3.1 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)取生長抑素原料藥對(duì)照品12.815mg(精密稱定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為0.05126 mg/mL生長抑素原料藥溶液。用上述UPLC超高效液相色譜法色譜條件 ,在一天內(nèi)連續(xù)測(cè)定六次.結(jié)果顯示,生長抑素的峰面積的RSD為0.24，系統(tǒng)精密度良好，結(jié)果見表3表3 系統(tǒng)精密度考察結(jié)果（n=6）編號(hào)峰面積平均峰面積RSD(%)18587108571520.24285605838576704860163585509768552143.2 回收率試驗(yàn)取生長抑素原料藥樣品三組，每組三份，第一組：8mg；第二組：10mg；第三組：12mg。具體為第一組：8.56mg、8.58mg、8.61mg。第二組：10.01mg、 11.2mg、10.98mg。第三組：14.42mg、13.66mg、15.23mg。分別置入200 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻。用上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定,得出超高效液相色譜法平均回收率為99.1%，SD為1.7%。說明準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）稱樣量(mg) 含有量（mg） 測(cè)得量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%)8.56 7.71 7.69 99.88.58 7.72 7.67 99.3 8.61 7.75 7.51 96.910.01 9.09 9.06 99.711.12 10.01 9.96 99.510.98 9.88 9.83 99.514.42 12.98 13.01 100.213.66 12.29 12.32 100.315.23 13.71 13.57 99.299.1 1.73.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取生長抑素原料藥樣品11.365mg (精密稱定，含量88.3%)，置250mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為0.05126 mg/mL生長抑素原料藥溶液。用上述超高效液相色譜法色譜條件,在0h、4h、8h 、12h 、24h 、48h進(jìn)行測(cè)定，以生長抑素的峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，測(cè)得RSD為0.5。表明，至少在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果如表5 表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）編號(hào) 時(shí)間（h） 峰面積 平均峰面積 RSD（%）1 0 857403 2 4 8497163 8 852136 855584 0.54 12 8553715 24 8589136 48 8599673.4 重復(fù)性試驗(yàn)取生長抑素原料藥樣品6份(分別為12.123g, 12.562g, 12.697g, 11.985g, 12.437g, 12.218g)置于250mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻。分別配成濃度為0.048492mg/mL，0.050248 mg/mL，0.050716 mg/mL，0.04794 mg/mL，0.049748 mg/mL，0.048872 mg/mL的生長抑素原料藥溶液，在上述超高效液相色譜法的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，生長抑素的平均含量為89.8%，RSD為0.7%，重現(xiàn)性良好。結(jié)果如表6表6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）編號(hào) 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）1 89.312 88.923 90.13 89.8 0.74 89.825 90.516 90.323.5 樣品測(cè)定3.5.1 取三批生長抑素原料藥，分別為11.983g,12.685g,13.217g.溶于250mL的容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，制備成生長抑素原料藥的溶液。用上述的超高效液相色譜法的方法，每個(gè)批次進(jìn)樣兩針，根據(jù)色譜圖的積分結(jié)果，得出生長抑素的含量，結(jié)果見表7表7 UPLC法測(cè)定生長抑素原料藥的含量樣品批號(hào) 峰面積 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 851469 89.21849159 89.1320090902 948697 90.52 90.14 0.8956872 90.6620091101 986544 91.11 981309 90.213.5.2 取與上述相同批號(hào)的三批生長抑素原料藥，按照中國藥典2010版第二部中的方法,用HPLC進(jìn)行測(cè)定。條件如下：色譜條件，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑：以磷酸溶液（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000）-乙腈（色譜純）為流動(dòng)相，HPLC：Waters 2695 配置Waters 2489 UV/visible Detector，色譜柱：Welch Materials XB-C18 5um, 4.6*250mm (100A) 流動(dòng)相A：磷酸（取磷酸11mL，加水900mL，用三乙胺調(diào)PH至2.3，用水稀釋至刻度1000搖勻）,流動(dòng)相B:乙腈，進(jìn)樣體積：10L，流速：1.0mL/min，檢測(cè)波長：215nm，柱溫：45 。洗脫條件（見表8）表8時(shí)間（Min）流動(dòng)相A()流動(dòng)相B()01820217960607921404021267921圖2 生長抑素的HPLC色譜圖測(cè)定結(jié)果（見表9、圖2）表9 HPLC法測(cè)定生長抑素原料藥的含量樣品批號(hào) 峰面積 含量（%） 平均含量（%） RSD（%）20090801 3143407 90.643179832 90.7120090902 3201739 90.93 90.5 0.43098451 89.9220091101 3157923 90.623102573 90.32上述為UPLC和HPLC分別對(duì)三批生長抑素原料藥的含量的測(cè)定結(jié)果，其中HPLC測(cè)定生長抑素原料藥的含量的方法已經(jīng)過驗(yàn)證6。用HPLC測(cè)定的生長抑素原料藥的含量為90.5%，RSD為0.4%。用UPLC測(cè)得的含量為90.14%，RSD為0.8%，與HPLC測(cè)得的含量很接近，且RSD為0.8%，重復(fù)性較好。4討論本文建立ACQUITY UPLC-PDA系統(tǒng)檢測(cè)生長抑素原料藥的方法，該方法的出峰時(shí)間僅為4分鐘，與HPLC的10分鐘的出峰時(shí)間相比7，時(shí)間減少了60%，能夠快速的檢測(cè)生長抑素原料藥的含量。本文所使用的UPLC方法中洗脫條件是從HPLC方法直接轉(zhuǎn)換過來，并嘗試過不同的流速，發(fā)現(xiàn)0.3ml/min的流速能達(dá)到要求,分離度、柱壓等均能符合實(shí)驗(yàn)要求，所以選用此流速作為本實(shí)驗(yàn)的流速。本文使用UPLC對(duì)生長抑素原料藥通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，系統(tǒng)精密度、回收率試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、以及不同批號(hào)的樣品的測(cè)定。在系統(tǒng)精密度實(shí)驗(yàn)中得出生長抑素的峰面積的RSD為0.24，表明系統(tǒng)精密度良好；在回收率試驗(yàn)中得出平均回收率為 99.1%，RSD為1.7%，表明系統(tǒng)的準(zhǔn)確度良好；在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，通過對(duì)生長抑素原料藥樣品在0h4h8h 12h 24h 48h的測(cè)定，以生長抑素的峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，得出RSD為0.5，表明，至少在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定；在重復(fù)性試驗(yàn)中，用生長抑素的含量測(cè)定考察，得出生長抑素的平均含量為89.8%，RSD為0.7%，表明重現(xiàn)性良好；在不同批號(hào)的樣品的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，分別用HPLC和UPLC對(duì)三批生長抑素原料藥進(jìn)行測(cè)定，用UPLC測(cè)得的含量為90.14%，RSD為0.8%，與HPLC測(cè)得的含量很接近，且RSD為0.8%，重復(fù)性較好。與傳統(tǒng)的HPLC方法相比，在速度，準(zhǔn)確率，靈敏度方面具有明顯的提高8。另外，由于UPLC在出峰時(shí)間方面的縮短不僅節(jié)約了時(shí)間，提高了檢測(cè)的效率，還在很大的程度上節(jié)省了流動(dòng)相的消耗，為使用單位在經(jīng)濟(jì)方面節(jié)約了不少。綜上所述,基于UPLC方法快速，準(zhǔn)確，靈敏以及低消耗的特點(diǎn)，它必將作為一個(gè)更好的方法而在含量檢測(cè)方面成為大眾的選擇。參考文獻(xiàn)1 中國藥典2010.第二部，生長抑素,p166-167.2 陳建忠，孫慶龍. 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