中藥龜甲膠的質(zhì)量控制方法研究.docx

中藥龜甲膠的質(zhì)量控制方法研究劉琳 1，張貴鋒 2*，查圣華 3，孔英俊 2，高建萍 2，王明林 1*，張宏 3，蘇志國(guó) 2（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018； 2中科院過(guò)程工程研究所，北京 100190； 3同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司，北京 100022）摘要 目的：研究龜甲膠酶產(chǎn)物的多肽組成，探索基于特征多肽的龜甲膠質(zhì)量控制方法；方法：利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合酶解技術(shù)，比較龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物的多肽組成，篩選差異性多肽；結(jié)果：龜甲膠酶解 產(chǎn)物中檢測(cè)出特征多肽，其對(duì)應(yīng)離子分別為 m/z 856.0 和 m/z 732.7，而牛明膠中檢測(cè)出的多肽(m/z 727.8 和 m/z 782.5)在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測(cè)出。結(jié)論：龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物存在差異性多肽，基于特征多肽 或特征離子的龜甲膠質(zhì)量控制方法具有可行性。關(guān)鍵詞 龜甲膠；質(zhì)量控制；牛明膠；特征多肽；液質(zhì)聯(lián)用龜甲膠是龜甲經(jīng)過(guò)漂泡、煎煮和濃縮等處理并添加輔料制成的固體膠，其功效包括滋陰潛陽(yáng)、益腎強(qiáng)骨和養(yǎng)血補(bǔ)心等。龜甲膠主要成分為可溶性膠原蛋白及其降解產(chǎn)物1-3。近 年來(lái)隨著龜甲膠等膠類中藥的需求量不斷上升，市場(chǎng)上出現(xiàn)了摻加牛皮膠甚至皮革降解物偽 品龜甲膠，其有效功效較低甚至產(chǎn)生毒副作用。研究龜甲膠中蛋白質(zhì)或多肽組成并篩選特征 性多肽不僅有利于龜甲膠質(zhì)量控制，而且有利于建立相應(yīng)的真?zhèn)舞b別方法。張思巨4等采用 IR、UV、TCL 和 HPLC 等技術(shù)研究了龜甲膠、鹿角膠和阿膠的理化性 質(zhì)并嘗試用于三種膠的鑒別，但由于不同動(dòng)物膠的宏觀性質(zhì)相似，采用這些方法難以獲得有 顯著差異的信息。李春梅5等人利用 SELDI-TOF MS 分析了龜甲膠的蛋白質(zhì)組成，但未比較 不同動(dòng)物膠的蛋白質(zhì)或多肽組成差異。其它方法如示差掃描量熱法6、等電聚焦電泳法7和 圓二色譜法8等也曾嘗試用于膠類中藥的鑒別。由于膠類中藥制備過(guò)程中需添加輔料且不同 廠家使用的輔料存在差異，龜甲膠在成分、分子量范圍和光譜特性等性質(zhì)不穩(wěn)定。龜甲膠中存在大量的膠原蛋白降解物，不同動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白其氨基酸序列會(huì)存在 差異9，這些差異可作為區(qū)分不同動(dòng)物膠原或明膠的依據(jù)9,10。本研究擬采用 HPLC-MS 結(jié) 合蛋白酶切技術(shù)比較龜甲膠和牛皮膠酶解產(chǎn)物中的多肽組成差異，篩選特征離子或特征多 肽，探索一種基于特征多肽的龜甲膠質(zhì)量控制方法。1 材料與方法1.1 樣品來(lái)源龜甲膠購(gòu)自北京同仁堂藥店；牛明膠購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司。1.2 儀器與試劑胰蛋白酶(序列純)購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；牛 I 型明膠購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司， 2,4-二硝 基氟苯(DNFB)購(gòu)自 Acros Organics 公司，其他試劑均為市售分析純。液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo 公司 LCQ DecaXP 質(zhì)譜組成，數(shù)據(jù)采集與處理軟件分別為 Xcalibur1.3 和 Biowroks3.1。2891.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 樣品處理稱取 1 g 研磨后的龜甲膠樣品，加入 20 mL 水，50水浴溶解，室溫 10 000 r min-1 離心 15 min，取清液加入 20%飽和三氯乙酸，4保存 10 min，10 000 r min-1 離心 15 min，收 集上清液和沉淀物。將沉淀物重新溶解于水中，調(diào) pH8.0，加入 100 L 胰蛋白酶 37酶解 12 h，采用 HPLC-MS 分析其多肽組成。1.3.2 分析方法1.3.2.1 凝膠過(guò)濾色譜分析 色譜柱 TSK G3000SWxL(7.830 cm, 5 m)；流動(dòng)相 0.02 mol L-1磷酸緩沖液(pH7.0)；流速 0.5 mL min-1；進(jìn)樣量 20 L；紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 214 nm。1.3.2.2 氨基酸組成分析 樣品水解、DNFB 法氨基酸衍生和液相條件分析條件參照文獻(xiàn)11。1.3.2.3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析色譜柱 ZORBAX SB-C18(2.1150 mm, 5 m)；流動(dòng)相： 水(0.1%TFA)(A), 乙腈(0.1%TFA)(B)；梯度 0100 min，5%40%B；100120 min，40%70%B；進(jìn)樣量樣品 20 L；流速 0.2 mL min-1。質(zhì)譜條件噴霧電壓 4.5 kV；毛細(xì)管溫度為 300； 鞘氣(N2)60 個(gè)單位；正離子模式，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍 m/z300900,精確質(zhì)量數(shù)掃描(Zoomscan) 和二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)掃描均為數(shù)據(jù)依賴型掃描(Data Dependent Scan)；動(dòng)態(tài)排除次數(shù) 1；動(dòng)態(tài) 排除時(shí)間 0.5 min；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量 35%，上述質(zhì)譜條件中掃描范圍更改為 m/z 9001 400 和 1 4002 000，重復(fù)進(jìn)樣。1.3.2.4 數(shù)據(jù)處理從 UniProtKB/Swiss-Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)中提取全部膠原蛋白序列的數(shù)據(jù)庫(kù)。將質(zhì) 譜數(shù)據(jù)使用 Biowork 軟件中 Turbosequest 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，檢索結(jié)果過(guò)濾參數(shù)：Xcorr1.5， DeltaCn0.1，二級(jí)質(zhì)譜離子數(shù)量15，并綜合考慮目標(biāo)離子色譜峰的信噪比及二級(jí)質(zhì)譜圖中 b、y 離子匹配性和連續(xù)性。2 結(jié)果2.1 凝膠過(guò)濾色譜分析 龜甲膠樣品溶解后經(jīng)離心處理形成上下兩層，上次呈乳白色粘稠狀，下層為澄清透明的溶液。有研究報(bào)道龜甲膠中主要包含蛋白質(zhì)和多肽類、多糖類和脂類物質(zhì)11,12，樣品溶液經(jīng) 離心后分成的兩層中上層主要為脂類物質(zhì)，多糖和蛋白質(zhì)及多肽類物質(zhì)分布在下層溶液，圖 1A 是下層溶液的凝膠過(guò)濾色譜圖。下層溶液經(jīng) TCA 處理后出現(xiàn)沉淀物，實(shí)驗(yàn)采用凝膠過(guò)濾 色譜對(duì)上清液和重新溶解的沉淀物進(jìn)行了分析。圖 1B 是下層沉淀物重新溶解后的凝膠過(guò)濾 分析結(jié)果，表明樣品溶解經(jīng) TCA 沉淀后下層沉淀物具有較高的分子量分布，沉淀物經(jīng)考馬 斯亮藍(lán)法分析的結(jié)果表明沉淀物主要是蛋白類物質(zhì)。上清液中的組分平均分子量較低，在保 留時(shí)間 1320 min 范圍內(nèi)未檢測(cè)分子量較高的組分(圖 1C)。由于糖類物質(zhì)在 TCA 溶液中可 溶解，因此，TCA 沉淀處理后樣品中的多糖類物質(zhì)主要存在于上清液?？捡R斯亮藍(lán)法分析 結(jié)果表明上清液中存在少量蛋白或多肽類物質(zhì)，但平均分子量較低，應(yīng)屬于膠原蛋白降解后 的低分子量多肽類物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)將沉淀物充分洗滌后進(jìn)行了酶解處理，圖 1D 是酶解產(chǎn)物的凝膠過(guò)濾分析結(jié)果，表 明沉淀物的酶解液保留時(shí)間主要集中在 29 min 左右，比圖 1B 保留時(shí)間 13.5 min 明顯延后， 說(shuō)明龜甲膠中蛋白質(zhì)被酶解成分子質(zhì)量較小的多肽片段。2.2 氨基酸組成分析290為研究龜甲膠中蛋白質(zhì)的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)首先將經(jīng)過(guò) TCA 處理后的沉淀物進(jìn)行了水解，采用 DNFB 法衍生后采用 HPLC 進(jìn)行了氨基酸組成分析。圖 2 是樣品的氨基酸組成分析 HPLC 圖譜，氨基酸組成分析結(jié)果見(jiàn)表 1，結(jié)果表明龜甲膠含有膠原蛋白特有的羥脯氨酸，含量約 占總氨基酸含量的 10%，與脯氨酸之和約占 20%，甘氨酸含量約占 32.5%，未檢出蛋氨酸和 半胱氨酸，這種氨基酸組成與膠原蛋白的氨基酸組成特征較為一致，說(shuō)明龜甲膠中主要蛋白 質(zhì)是膠原蛋白。樣品中甘氨酸含量低于 33%(膠原蛋白核心序列氨基酸組成特征)，表明龜甲 膠中也存在少量的非膠原類蛋白質(zhì)或多肽13。A龜甲膠溶解并離心后的清液；B龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過(guò) TCA 處理后的沉淀物；C龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過(guò) TCA 處理后的上清液；D龜甲膠溶液離心后的清液經(jīng)過(guò) TCA 處理后的沉淀物酶解 產(chǎn)物圖 1 龜甲膠的凝膠過(guò)濾譜圖圖 2 龜甲膠氨基酸組成分析 HPLC 圖表 1 氨基酸組成分析表氨基酸含量*氨基酸含量*天冬氨酸谷氨酸 羥脯氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 甘氨酸 脯氨酸 精氨酸6310399321632510953丙氨酸纈氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 組氨酸 賴氨酸 酪氨酸95221528103244注：*龜甲膠中氨基酸含量以每 1000 個(gè)氨基酸殘基中的氨基酸的比例計(jì)算291圖 3 牛明膠(A)和龜甲膠(B)酶解產(chǎn)物質(zhì)譜分析總離子流圖2.3 酶解產(chǎn)物 HPLC-MS 分析氨基酸組成分析結(jié)果表明龜甲膠中主要是膠原蛋白降解物，分子量分布范圍寬且多肽 的親疏水性相近。圖 3 表明龜甲膠的酶解質(zhì)譜圖與牛明膠酶解產(chǎn)物質(zhì)譜圖中多肽的保留時(shí)間 分布和分子量范圍較為相似，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的檢索結(jié)果也表明兩種膠的酶解產(chǎn)物中存在大量相同 氨基酸序列的多肽，其原因在于不同動(dòng)物來(lái)源膠原蛋白的整體氨基酸組成差異并不顯著且存 在局部相同的氨基酸序列，酶解后這些多肽被釋放并形成質(zhì)荷比相同的離子。不同動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白序列存在局部氨基酸差異，膠原蛋白降解后的明膠經(jīng)酶解處 理后可形成有序列差異的多肽。實(shí)驗(yàn)采用數(shù)據(jù)比對(duì)的方法對(duì)圖 3 中龜甲膠與牛明膠的酶解產(chǎn) 物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并對(duì)存在差異的離子進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明龜甲膠酶解產(chǎn)物中存 在部分多肽，這些多肽對(duì)應(yīng)的離子在牛明膠酶解產(chǎn)物中未檢出。圖 4 是龜甲膠酶解產(chǎn)物質(zhì)譜 分析獲得的提取離子流圖，檢測(cè)出保留時(shí)間為 37.15 min 特征性多肽(m/z 856.0)；盡管牛明 膠中存在保留時(shí)間為 57.99 min 的 m/z 856.0 離子(圖 4B)，但其帶電荷狀態(tài)以及二級(jí)質(zhì)譜均與 圖 4A 中離子 m/z 856.0 的帶電荷狀態(tài)以及二級(jí)質(zhì)譜存在顯著差異，表明其氨基酸序列不同。 龜甲膠中存在保留時(shí)間為 40.68 min 的特征性多肽(m/z 732.7)(圖 4C)，而牛明膠酶解產(chǎn)物中 未檢測(cè)出該離子以及對(duì)應(yīng)的多肽(圖 4D)。數(shù)據(jù)檢索結(jié)果表明龜甲膠中還存在其它特征多肽，這些多肽與牛膠原蛋白序列中對(duì)應(yīng)的多肽局部氨基酸殘基發(fā)生了變化。A.龜甲膠 m/z 856.0；B.牛明膠 m/z 856.0；C.龜甲膠 m/z 732.7；D.牛明膠 m/z 732.7圖 4 龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物提取離子流圖292數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)果表明牛明膠酶解產(chǎn)物也存在許多特征多肽，其對(duì)應(yīng)的離子在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測(cè)出，這些多肽可作為鑒定龜甲膠樣品中是否存在牛明膠的標(biāo)志物。圖 5 是牛明 膠酶解產(chǎn)物質(zhì)譜分析后的提取離子流圖，檢測(cè)出保留時(shí)間為 52.06 min 特征性多肽 (m/z727.8)(圖 5B)，而龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測(cè)出該多肽(圖 5A)；牛明膠酶解產(chǎn)物中檢測(cè)出 m/z782.5 的特征多肽，其保留時(shí)間分別為 45.33 min、46.75 min、48.43 min 和 49.54 min(圖 5D)，而龜甲膠酶解產(chǎn)物中未檢測(cè)出 m/z782.5 的多肽(圖 5C)。牛明膠酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜 集結(jié)果還存在其它多肽，其序列具有特征性且在龜甲膠酶解產(chǎn)物中未被檢測(cè)。A.龜甲膠 m/z 727.8；B.牛明膠 m/z 727.8；C.龜甲膠 m/z 782.5；D 牛明膠 m/z 782.5圖 5 龜甲膠和牛明膠酶解產(chǎn)物提取離子流圖脯氨酸(Pro)羥基化修飾形成羥脯氨酸是膠原蛋白序列中最為常見(jiàn)的翻譯后修飾，有研究表明哺乳動(dòng)物在其不同生長(zhǎng)時(shí)期以及不同組織中，羥基化修飾位置和修飾程度存在一定差 異，使用質(zhì)譜法進(jìn)行多肽識(shí)別需綜合考慮多肽可能存在的羥基化修飾。牛明膠酶解產(chǎn)物提取 離子流圖中保留時(shí)間分別為 45.33 , 46.75 , 48.43, 49.54 min 色譜峰中多肽具有相同的質(zhì)荷比 (m/z 782.5)，序列分析結(jié)果表明這些多肽具有相同的氨基酸序列，但羥基化修飾位置存在差 異。利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)龜甲膠中特征多肽過(guò)程中，不同樣品中特征多肽的 Xcorr 和 DeltaCn 值可能會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，主要原因在于脯氨酸的羥基化修飾不均一導(dǎo)致同一序列出現(xiàn)多條檢索結(jié) 果，需要結(jié)合多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)通過(guò)碎片離子的種類確定發(fā)生羥基化修飾的具體位置。3 討論龜甲膠以龜甲為原料經(jīng)熬制并添加一些輔料制成，龜甲中存在蛋白質(zhì)(膠原蛋白和角蛋 白等)、糖胺多糖、脂類和無(wú)機(jī)鹽14-16等，這些物質(zhì)在熬制過(guò)程中發(fā)生降解導(dǎo)致組成更為復(fù) 雜，基于理化性質(zhì)的鑒別方法存在諸多不穩(wěn)定因素。為了去除樣品中的非膠原多肽類物質(zhì)的 干擾，實(shí)驗(yàn)首先采用沉淀法對(duì)樣品進(jìn)行了預(yù)處理，以使高分子量的膠原蛋白降解物沉淀出， 提高特征多肽的檢出率。龜甲中膠原蛋白含量較高，因此龜甲膠中含有一定量的膠原蛋白降 解物，不同動(dòng)物膠原蛋白之間的氨基酸序列差異是基于特征多肽的質(zhì)量控制方法的理論基 礎(chǔ)。然而，由于龜甲膠分子量高且分布范圍寬，難以采用質(zhì)譜直接進(jìn)行分析，因此實(shí)驗(yàn)采用 酶解技術(shù)進(jìn)行了樣品處理，以降低龜甲膠中多肽的分子量并使特征多肽得以釋放。293由于膠原蛋白隨著動(dòng)物年齡和生長(zhǎng)情況發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，導(dǎo)致龜甲中脯氨酸和羥脯氨酸相對(duì)比例發(fā)生變化，利用質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)龜甲膠中的特征多肽需考慮羥基化修飾的影響，尤其 是質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析時(shí)需要在搜索參數(shù)中設(shè)置脯氨酸發(fā)生羥基化修飾的參數(shù),以提高特征多肽的 識(shí)別率。本研究以不同動(dòng)物之間膠原蛋白序列差異為基礎(chǔ)，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)酶解 技術(shù)進(jìn)行了多肽檢測(cè)，證明了基于特征多肽的龜甲膠質(zhì)量控制方法具有可行性，為深入研究龜甲膠的組成以及相應(yīng)的有效成分研究提供了理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1Nobuhiro Naqai, Hatsumi Kobayashi, Shizuka Katayama, et al. 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