入侵植物春飛蓬的生物檢定與化學成分討論論文.doc

入侵植物春飛蓬的生物檢定與化學成分討論論文 春飛蓬(ErigeronphiladelphicusL.)為菊科(Compositae)飛蓬屬(Erigeron)植物又名費城飛蓬與一年蓬(Erigeronannuus(L.)Pers.)的植物形態(tài)極其相似該植物于20XX年出現(xiàn)在我國浙江、福建、上海、江蘇和安徽等省市是一種源自北美的外來入侵植物20XX年山東境內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有春飛蓬我們對其進行了初步研究 1實驗材料、儀器與試藥 1.1實驗材料 所用實驗樣品于20XX年5月采自山東濟南經(jīng)山東中醫(yī)藥大學生藥教研室徐凌川教授鑒定為菊科飛蓬屬植物春飛蓬(E.philadelphicus)L.地上部分;花粉粒的對照樣品采自一年蓬(E.annuus(L.)Pers.)的花序一并通過鑒定;春飛蓬的干燥地上部分粉粹后過40目篩備用 1.2儀器 SUPRATM55熱場掃描電子顯微鏡(德國蔡司公司);DK8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司);DYY8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海琪特分析儀器有限公司);YXJ2離心機(湘儀離心機儀器有限公司);PCR反應擴增儀(加拿大BBI公司);H61微型電泳槽(上海精益有機玻璃制品儀器廠);凝膠成像系統(tǒng)(GeneGenius公司);U3010紫外可見分光光度計(日立公司);Blospin植物基因組DNA提取試劑盒;移液器范圍(1001000mL20200mL0.510mL)(賽默飛世爾科技公司);UV5800(上海元析有限公司);Waterse2695高效液相色譜儀(美國沃特世公司)等 1.3試藥 蘆丁對照品(批號:YM0313SA14);燈盞花乙素(野黃芩苷)對照品(批號:ZM0520XA14)亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇所用試劑均為分析純 2實驗方法與結果 2.1基原鑒別春飛蓬為一年生或越年生草本植物莖直立高30100cm粗壯上部有分枝植物密被開展長硬毛及短硬毛(毛較多明顯)葉互生基生葉蓮座狀卵形或卵狀倒披針形兩面被倒伏的硬毛葉緣具粗齒花期不枯萎莖生葉基部半抱莖;中上部葉披針形或條狀線形頂端尖基部漸狹無柄邊緣有疏齒被硬毛頭狀花序數(shù)枚直徑68mm總苞片3層草質披針形長35mm淡綠色邊緣半透明中脈褐色背面被毛;舌狀花2層雌性舌片線形長約6mm平展蕾期下垂花期仍斜舉舌狀花白色略帶粉紅色管狀花兩性黃色花期為35月皮細胞及氣孔2花粉粒3導管4纖維5冠毛6花藥碎片7非腺毛8莖部薄壁細胞(細胞壁念珠狀增厚)圖1春飛蓬粉末圖Fig.1PowderfigureofE.philadelphicusL. 2.2顯微鑒別 2.2.1粉末的顯微觀察黃綠色水合氯醛加熱透化裝片可見具三孔溝、近圓形的花粉粒表面為齒狀凸起直徑約為1820m非腺毛基部為23個細胞并列頂端細胞尾尖形如刺刀氣孔橢圓形為不定式纖維多成束存在壁厚導管多為螺紋導管莖部薄壁細胞其壁呈念珠狀增厚 2.2.2花粉粒的觀察取春飛蓬與一年蓬的花粉于標本托上噴金后分別觀察兩者的花粉粒掃描電鏡圖顯示春飛蓬花粉粒的齒狀紋飾稀疏頂端刺漸尖直徑約為18m(圖2a);而一年蓬的齒狀凸起相對較多且花粉粒直徑大約為22m齒狀凸起基部膨大頂端刺驟尖 2.3分子鑒別 2.3.1方法通過Blospin植物基因組DNA提取試劑盒來分別提取兩種植物的總DNA利用一對通用引物ITS1ITS4進行PCR擴增(ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)通用引物由上海生工生物工程有限公司合成PCR擴增反應體系:2Taqmastermix25L、DNA模板4L、ITS1引物2L、ITS4引物2L、ddH2O17L將反應體系中的所有成分精密移取至PCR管中并充分混勻后放入PCR儀中擴增程序:94預變性3min再進行35個循環(huán)(94變性30s50退火30s72延伸1min)最后72延伸10min產(chǎn)物于4冰箱保存PCR產(chǎn)物檢測:PCR產(chǎn)物5L用3LEB染色在濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測用凝膠成像儀照相PCR產(chǎn)物測序:將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序 2.3.2實驗結果將本實驗所得的ITS序列輸入到NCBI上的GenBank上Blast后進行同源率分析結果顯示1號與春飛蓬同源率為99%我們可以認定為該植物即為春飛蓬;2號與一年蓬同源率為99%可以判定該植物為一年蓬故可從分子方面對兩者進行區(qū)分 2.4總黃酮含量測定 2.4.1對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.0mg置100mL量瓶加70%乙醇定容至刻度即得對照品溶液 2.4.2供試品溶液的制備取春飛蓬粗粉約2.5g精密稱定后加入14倍量70%乙醇加熱回流提取3次(1h1h1h)3次回流后合并濾液使其在水浴上蒸干溶劑最后用70%乙醇定容至500mL量瓶中即得 2.4.3標準曲線的繪制精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5mL分別置于10mL量瓶分別加入70%乙醇2mL精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3mL搖勻放置6min精密加入10%硝酸鋁溶液0.3mL混勻放置6min精密加入氫氧化鈉試液2mL搖勻放置10min用70%乙醇稀釋至刻度以相應試劑為空白采用紫外可見分光光度法在510nm波長處測定吸光度以蘆丁對照品濃度為縱坐標(Y)溶液吸光度值為橫坐標(X)作標準曲線回歸方程為Y=0.0684X+0.0028R=0.9999結果表明蘆丁對照品濃度在550gmL范圍內(nèi)與溶液的吸光度之間呈良好的線性關系 2.4.4計算總黃酮含量根據(jù)紫外可見分光光度法在510nm波長處測定吸光度值由標準曲線讀出濃度計算其總黃酮含量由實驗數(shù)據(jù)得出春飛蓬中總黃酮含量約為0.59% 2.5燈盞花乙素含量測定對照品與供試品溶液均按20XX版藥典方法制備按照20XX版中國藥典燈盞花乙素含量測定方法測定結果未測出燈盞花乙素 3討論 春飛蓬原產(chǎn)北美是一種外來入侵植物最近幾年在中國南方城市發(fā)現(xiàn)但在山東境內(nèi)發(fā)現(xiàn)屬首次報道因其植物形態(tài)與一年蓬極近似常會被誤認為一年蓬可先從形態(tài)特征如葉先端的形態(tài)、花的開放特點和花期以及毛茸等幾個方面仔細加以區(qū)別再者可以通過分子鑒定方法進一步區(qū)別通過對春飛蓬進行初步鑒定研究表明其粉末中主要顯微特征有花粉粒、多細胞非腺毛、螺紋導管、表皮細胞及不定式氣孔、纖維、冠毛、花藥碎片和莖部薄壁細胞等;從花粉粒掃描電鏡圖可以看出春飛蓬花粉粒比一年蓬花粉粒的直徑小且外壁紋飾的齒狀突起更稀疏、更短鈍;得到了春飛蓬的ITS序列;紫外可見分光光度法測得春飛蓬全植株中總黃酮含量為0.59%;燈盞花乙素未檢測出資料報道全世界飛蓬屬植物種類共計200余種其中經(jīng)過研究的有30多種我國對飛蓬屬植物研究較深入的只有短亭飛蓬(