細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)技術(shù).ppt

腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室張寧PI組 腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)常用研究方法 Textinhere 侵襲實(shí)驗(yàn) 趨化運(yùn)動(dòng) 實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞劃痕法是測(cè)定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性的方法之一 在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上 劃痕致傷 然后在加入藥物等實(shí)驗(yàn)條件下觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響 劃痕實(shí)驗(yàn) 傷口愈合實(shí)驗(yàn) ScratchAssay 操作步驟 1 先用marker筆在6孔板背后 用直尺比著 均勻的劃?rùn)M線 大約每隔0 5 1cm一道 橫穿過(guò)孔 每孔至少穿過(guò)3條線 操作步驟 2 在孔中加入約5 105個(gè)細(xì)胞 具體數(shù)量因細(xì)胞種類不同而不同 接種原則為過(guò)夜后融合率達(dá)到100 3 用10mltip槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕 PBS洗滌2次 去除劃下的細(xì)胞 加入無(wú)血清培養(yǎng)基 操作步驟 4 放入37 5 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 每3h測(cè)量一次細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離 拍照 具體時(shí)間依實(shí)驗(yàn)需要而定 操作步驟 5 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的距離長(zhǎng)度 0時(shí)距離 每個(gè)時(shí)間長(zhǎng)度細(xì)胞整體遷移的距離 求出均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差 時(shí)間為橫軸 遷移距離為縱軸 單位mm 作圖 并比較初始0時(shí)與實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的照片 注意事項(xiàng) 1 在用PBS緩沖液沖洗時(shí) 注意貼壁慢慢加入 以免沖散單層貼壁細(xì)胞 影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果 2 一般做劃痕實(shí)驗(yàn) 都是無(wú)血清或者低血清 2 否則細(xì)胞增殖就不能忽略 3 按照6孔板背后畫線的垂直方向劃痕 可以形成若干交叉點(diǎn) 作為固定的檢測(cè)點(diǎn) 以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問(wèn)題 4 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度 對(duì)不同的細(xì)胞要觀察細(xì)胞的貼壁率等 確定實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間 保證培養(yǎng)終止時(shí)密度適當(dāng) 實(shí)驗(yàn)原理趨化運(yùn)動(dòng)是指細(xì)胞能夠感受到外界化學(xué)物質(zhì)的濃度梯度 并沿著濃度梯度的方向所做的定向運(yùn)動(dòng) 趨化運(yùn)動(dòng)是一個(gè)非常保守的過(guò)程 對(duì)于生物體的生存 生命的繁衍等具有重要的意義 趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn) ChemotaxisAssay 微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn) 微孔小室中的趨化實(shí)驗(yàn)是根據(jù)靶細(xì)胞 單核巨噬細(xì)胞 中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等 能夠趨化性主動(dòng)遷移 穿過(guò)一定孔徑的濾膜而設(shè)計(jì)的 濾膜 聚碳酸脂膜 將小室分隔成上下兩部分 靶細(xì)胞在上面 趨化因子在下面 趨化因子通過(guò)濾膜形成梯度 細(xì)胞則沿著梯度穿過(guò)膜孔 黏附在膜的下面 計(jì)數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測(cè)出趨化因子的趨化能力 BoydenChamber裝置 實(shí)驗(yàn)步驟 1 在冰盒內(nèi)將趨化因子由高濃度向低濃度稀釋 將不同濃度的趨化因子置于趨化小室的下室 30ml 孔 每個(gè)濃度加3個(gè)孔 其中只加BM的孔為陰性對(duì)照 2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞 0 1 BM重懸細(xì)胞 調(diào)整細(xì)胞濃度為5 105 ml 3 加樣 下室加不同濃度的趨化因子 將膜輕輕對(duì)折后展平 光面朝下毛面朝上 依次蓋上膠墊和上室將螺絲對(duì)稱擰上擰緊 在上室中加入細(xì)胞 50ml 孔 每個(gè)濃度加3個(gè)孔 實(shí)驗(yàn)步驟 4 將趨化小室在37 5 CO2的孵化箱中孵育3h 5 在膜的兩端加上夾子 毛面在PBS液面上蘸取 光面禁止碰到液體 毛面在架子上摩擦 再蘸取PBS 反復(fù)3次后再蘸取一次 晾干 6 固定 染色 實(shí)驗(yàn)步驟 7 取載玻片 剪角放在右上角 滴一滴石蠟 蓋玻片封片 8 顯微鏡觀察計(jì)數(shù) 每孔至少3個(gè)隨機(jī)視野 3個(gè)孔的數(shù)值取平均值 作柱狀圖 縱軸趨化指數(shù)或細(xì)胞數(shù) 橫軸組別 9 趨化指數(shù) ChemotaxisIndex 隨著趨化誘導(dǎo)因子的濃度梯度而遷移的細(xì)胞數(shù)目 用培養(yǎng)基做對(duì)照的遷移細(xì)胞數(shù)目 注意事項(xiàng) 1 膜 膠墊 上下小室之間防止有氣泡產(chǎn)生 2 放膜時(shí)要對(duì)準(zhǔn)位置 過(guò)多調(diào)整位置 易發(fā)生交叉污染 3 槍垂直 槍尖伸入孔中下大概4 5處 迅速加樣 不要遲疑 打出液體的過(guò)程槍逐漸抬起 液體全部打出時(shí)槍尖離開液面 4 洗膜時(shí)注意 不要把細(xì)胞面與非細(xì)胞面弄反 腫瘤細(xì)胞侵襲試驗(yàn) MatrigelInvassionAssay Transwell系統(tǒng) Transwell小室 0 4um孔徑聚碳酯膜的掃描電鏡 原理 人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel 是一種細(xì)胞外基質(zhì) 4 時(shí)是液體 在37 會(huì)逐漸凝固成膠狀 主要成分為層黏連蛋白和 型膠原 能在培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu) 這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似 濾膜孔徑一般為8mm 而且膜孔都被Matrigel覆蓋 細(xì)胞不能自由穿過(guò) 必須分泌水解酶 并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)這種鋪有Martrigel的濾膜 這與體內(nèi)情況較為相似 原理 Transwell電鏡圖片 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng) 1 無(wú)菌條件下Matrigel于冰浴融化 用PBS 或DMEMonly培養(yǎng)基 稀釋成1mg ml濃度 20 C凍存?zhèn)溆?2 取出已稀釋好的Matrigel 冰浴融化 以50ml的體積鋪于Tramwell小室 24孔板 聚碳酸酯膜上 注意 體積不可太大 以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好 37 C放置lh 使Matrigel聚合成凝膠 注意 加基質(zhì)膠時(shí)最好將24孔板放置在冰盒上 確保膠完全覆蓋孔底 不要有氣泡 3 每孔加入200ml1640 或DMEM 培養(yǎng)基使膠重構(gòu) 4 在Transwell下室中加入趨化因子或10 FBS培養(yǎng)基600ml 孔 5 在上室孔中準(zhǔn)確加入細(xì)胞l 105個(gè) 孔 細(xì)胞懸液體積200ml 置于5 CO2培養(yǎng)箱于37 C培養(yǎng)24h 注意 細(xì)胞量和時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件摸索 6 待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后 棄去上室液體 小心取出上室 用濕棉簽擦去膜上未穿過(guò)膜的細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng) 7 4 中性甲醛固