論文-洋槐蜜紅外指紋圖譜的研究.doc

目 錄題目I摘要IAbstractI1 前言11.1 紅外光譜在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用11.2 蜂蜜指紋圖譜的研究進(jìn)展22 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法32.1 實(shí)驗(yàn)材料32.1.1 材料32.1.2 儀器與試劑32.2 實(shí)驗(yàn)方法32.2.1 樣品溶液的配置32.2.2 紅外光譜條件的選擇33 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34 結(jié)論114.1 十種不同蜂蜜紅外光譜的比較114.2 洋槐原蜜與市售洋槐蜜紅外光譜的比較11參考文獻(xiàn)11致謝12 洋槐蜜紅外指紋圖譜的研究學(xué) 生：專(zhuān) 業(yè)：指導(dǎo)教師： 摘 要：目的 利用紅外光譜法并結(jié)合主成分分析法建立洋槐蜜的指紋圖譜，并與其他9種蜂蜜的紅外譜圖進(jìn)行鑒別比較。方法 紅外光譜法（IR）、主成分分析法和聚類(lèi)分析法。結(jié)果 通過(guò)分析十種蜂蜜的紅外指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析法，發(fā)現(xiàn)十種不同的蜂蜜在主成分一，主成分二，主成分三的二維散點(diǎn)圖和三維散點(diǎn)圖上的點(diǎn)都較為分散；通過(guò)分析洋槐原蜜和市售洋槐蜜的紅外指紋圖譜，并結(jié)合聚類(lèi)分析法，發(fā)現(xiàn)唯有一種洋槐蜜原蜜，被歸為加工的洋槐蜜中。結(jié)論 十種不同的蜂蜜在化學(xué)成分上存在一定的差異，該方法可以把洋槐蜜原蜜和加工后的洋槐蜜分開(kāi)。 關(guān)鍵詞: 洋槐蜜；蜂蜜；IR指紋圖譜 Study on IR Fingerprints of Robinia HoneyName: Chen LijuanMajor: The Science of Traditional Chinese MedicineTutor: Dong RuiAbstract: Objective We established the IR fingerprints of Robinia honey and compared with the IR fingerprints of nine other kinds of honey combined with principal component analysis. Methods Infrared spectrometry, principal component analysis and cluster analysis were used. Results We analyzed the IR fingerprints of ten different kinds of honey and found that their plots scattered in the 2D scatter and 3D scatter of first principal constituent, second principal constituent and third principal constituent by Principal component analysis. Cluster analysis was used to analyze Robinia original honey and Robinia honey sold in the market with IR fingerprints, and we found that only one Robinia original honey was ascribed to processed honey. Conclusion The ten different kinds of honey had some differences in chemical constituent. The experimental method could be used to separate Robinia original honey and processed ones. Keywords: Robinia honey; honey; IR FingerprintsI1 前 言目前指紋圖譜已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段13。它能全面的反映中藥的整體化學(xué)特征，體現(xiàn)其內(nèi)在的整體質(zhì)量，彌補(bǔ)了過(guò)去對(duì)中藥質(zhì)量控制中只對(duì)少數(shù)成分控制質(zhì)量的弊端，是一種更為合理的中藥質(zhì)量控制模式46。指紋圖譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)是以供試品指紋圖譜與該品種對(duì)照指紋圖譜(共有模式) 之間的相似性來(lái)衡量的, 這種相似性比較可以用“相似度”表達(dá)，綜合了樣品的定性信息和定量數(shù)據(jù)。根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的中藥注射劑指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南規(guī)定：指紋圖譜相似度可以借助國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的“中藥計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”計(jì)算7。中藥材的指紋圖譜系指中藥材經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)定該中藥材特性的共有峰的圖譜。根據(jù)所用分析手段將指紋圖譜分為：TLC, HPLC, GC, HSCCC, IR, UV, MS, NMR, HPCE, NIR, XRD指紋圖譜以及不同方法聯(lián)用技術(shù)建立的指紋圖譜。1.1 紅外光譜在中藥指紋圖譜中的應(yīng)用目前，近紅外指紋圖譜已成功應(yīng)用于中藥成分的鑒定和作物品種的鑒定和分類(lèi)。中藥的近紅外指紋圖譜是一種綜合的、整體的鑒定手段，它可準(zhǔn)確且又可量化地對(duì)藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)，其功用范圍在于鑒別真?zhèn)危约霸u(píng)價(jià)藥材的質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性。李峰8的研究表明，應(yīng)用紅外光譜建立金銀花的紅外指紋圖譜，可以用于反映和鑒別金銀花成分，以及區(qū)別不同來(lái)源和產(chǎn)地的金銀花藥材。黃寶康等9應(yīng)用近紅外漫反射指紋圖譜聚類(lèi)分析鑒別不同產(chǎn)地褚實(shí)子的真?zhèn)危l(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地褚實(shí)子之間指紋圖譜存在一定差異，與偽品差異較大。孫素琴等10利用紅外指紋圖譜并結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助對(duì)比軟件技術(shù)，對(duì)9個(gè)省份的45個(gè)山藥樣品進(jìn)行了道地性與非道地性的鑒別研究，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)地山藥的相關(guān)性有一定的差異性，該方法快速、簡(jiǎn)便、可靠。黃昊等11采用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)分析鑒別了350種中藥配方顆粒紅外指紋圖譜的結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果表明，借助于各種藥用植物和動(dòng)物配方顆粒的FTIR指紋圖譜的差別可進(jìn)行快速分類(lèi)鑒別。湯俊明等12借助于紅外指紋圖譜對(duì)各生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的中藥配方顆粒進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒別研究，結(jié)果表明，紅外指紋圖譜可直觀的反映出不同生產(chǎn)產(chǎn)家之間產(chǎn)品質(zhì)量的異同，同一廠家不同批號(hào)顆粒劑譜圖的可重現(xiàn)性，不同炮制方法及炮制前后的差異，以及同一炮制品不同批號(hào)的異同，能夠有效地對(duì)其產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了一種先進(jìn)、快速的分析手段。程翼宇等13采用基于貝葉斯準(zhǔn)則的多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行投影變換，再以二維灰度圖對(duì)變換后數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化表征，形成基于計(jì)算機(jī)圖像的虛擬化學(xué)指紋圖譜。將其用于鑒別3種不同產(chǎn)地中藥當(dāng)歸樣品的結(jié)果表明，它能有效提取紅外光譜分析數(shù)據(jù)的特征指紋，實(shí)現(xiàn)以虛擬指紋圖譜對(duì)藥材產(chǎn)地的分類(lèi)鑒別，從而為辨識(shí)復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)體系提供了新的技術(shù)手段。近紅外光譜法采用紅外光譜法原理，在近紅外區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，再運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)，建立樣本與信息之間的數(shù)學(xué)模型。隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)的發(fā)展和傅立葉近紅外光譜儀的引入，其應(yīng)用范圍不斷拓寬，能有效的對(duì)大量樣品進(jìn)行高精度快速分析。對(duì)于多組分測(cè)定，必須先用其他方法測(cè)定各組分的含量，然后建立每一組分與標(biāo)準(zhǔn)品之間的數(shù)學(xué)模型，最后運(yùn)用該模型對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析。但大多數(shù)中草藥成分不明，這就大大增加了其分析難度。傅里葉變換紅外光譜(FTIR) 由于具有指紋特征分析、譜圖整體分析、宏觀推斷分析等特點(diǎn)，適合于分析復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)組成的穩(wěn)定性，故成為當(dāng)今中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究領(lǐng)域的一個(gè)重要手段14。主成分分析法是一種有效的數(shù)據(jù)降維分析法，能將原始變量通過(guò)線性變換重新組合成一組新的變量，即一組主成分( PC) ，僅用部分主成分就可表達(dá)原有變量的主要信息，利用這一特性，可實(shí)現(xiàn)紅外光譜數(shù)據(jù)的線性降維投影顯示，從而使人們能直觀地從二維圖中觀察到光譜的主要特性和排序情況。1.2 蜂蜜指紋圖譜的研究進(jìn)展近些年來(lái)，不少科研工作者已應(yīng)用蜂蜜的各種指紋圖譜來(lái)研究蜂蜜的化學(xué)成分，區(qū)分不同蜜源的蜂蜜，控制蜂蜜的質(zhì)量。Compos15和Ferreres16對(duì)蜂產(chǎn)品中的黃酮類(lèi)化合物研究發(fā)現(xiàn)，蜂蜜含有高良姜精、短葉松素、楊梅酮等成分。不同的單花蜂蜜，黃酮類(lèi)化合物的種類(lèi)和含量存在驚人的差異。采用指紋圖譜技術(shù)研究不同蜂蜜中的微量生物活性物質(zhì)和非活性物質(zhì)，可以有效區(qū)分不同蜜源的蜂蜜，而且可以應(yīng)用于蜂蜜的質(zhì)量控制中，尤其在鑒別蜂蜜種類(lèi)、判別真假蜂蜜中17。Tomas等18在RP-HPLC上分析了蜂蜜中的 20 種黃酮苷元，試用了甲醇-水和乙腈-水的多種洗脫體系，但發(fā)現(xiàn)沒(méi)有一種溶劑體系能分析所有這些黃酮。Isabel 等19采用色譜技術(shù)從小桉樹(shù)蜜中鑒定出多種黃酮類(lèi)化合物，其中發(fā)現(xiàn)五羥基黃酮和毛地黃黃酮可作為桉樹(shù)蜜的標(biāo)記物，8-甲氧基-坎菲醇和坎菲醇可作為迷迭香蜜的標(biāo)記物。Yao等研究了與澳大利亞桉樹(shù)蜜的蜜源有關(guān)的7 種酚酸，同年還研究出沒(méi)食子酸和香豆酸可用于不同產(chǎn)地的桃金娘科桃金娘屬植物蜂蜜的鑒別20。Daniela等21研究了兩個(gè)季節(jié)的40種克羅地亞洋槐蜜的黃酮類(lèi)化合物的 HPLC圖譜。結(jié)果表明，雖然季節(jié)對(duì)黃酮類(lèi)化合物的含量有影響，但是單一物質(zhì)的百分比保持不變，而且發(fā)現(xiàn)干燥和高溫可以促成黃酮類(lèi)化合物的積累。以上的研究成果表明：研究蜂蜜的指紋圖譜對(duì)鑒別蜂蜜的種類(lèi)，評(píng)價(jià)蜂蜜質(zhì)量?jī)?yōu)劣具有重要的指導(dǎo)意義。2 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法2.1 實(shí)驗(yàn)材料2.1.1 材料 洋槐蜜原蜜樣品6個(gè)，由汪氏蜜蜂園公司提供；市售不同產(chǎn)地的洋槐蜜樣品6個(gè)，購(gòu)于沃爾瑪超市。黨參蜜、山花蜜、蒲公英蜜、枇杷蜜、紫云英蜜、龍眼蜜、益母草蜜、黃連蜜、荊條蜜均為未加工原蜜，由汪氏蜜蜂園提供。2.1.2 儀器與試劑傅立葉紅外變換光譜儀 日本島津；單晶溴化鉀 長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供；安伯萊特XAD-2大孔樹(shù)脂 美國(guó)Sigma-Aldrich；甲醇 北京化學(xué)試劑廠；移液槍 北京明力普瑞科技有限公司。2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 樣品溶液的配置準(zhǔn)確稱(chēng)取洋槐蜜(6個(gè)原蜜，6個(gè)市售)、黃連蜜、龍眼蜜、益母草蜜、蒲公英蜜、山花蜜、黨參蜜、紫云英蜜、荊條蜜、枇杷蜜各100g，分別溶于100mL蒸餾水中，過(guò)XAD-2大孔樹(shù)脂，先用1000mL蒸餾水洗后再用1000mL的甲醇洗，收集甲醇部分，減壓濃縮至干，色譜甲醇定容至10mL的容量瓶中, 通過(guò)0.45m 濾膜，濾液置于棕色樣品瓶中，作為供試品溶液，濃度為：10g/mL。2.2.2 紅外光譜條件的選擇紅外光譜條件：用移液槍精密吸取供試品溶液20L，均勻涂于單晶溴化鉀上，進(jìn)行紅外光譜的測(cè)定，掃描次數(shù)為10，分辨率為8cm-1，光譜范圍5004000cm-1。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果10種蜂蜜的紅外指紋圖譜如下：圖1洋槐原蜜IR圖譜Fig 1 The IR Spectrum of original Robinia honey圖2 市售洋槐蜜IR圖譜Fig. 2 The IR Spectrum of soled Robinia honey圖3 6種洋槐蜜原蜜樣品的IR疊加譜圖Fig. 3 Stacking charts of IR Spectrum of six kinds of original Robinia honey 圖4 6種市售洋槐蜜樣品的IR疊加譜圖Fig. 4 Stacking charts of IR Spectrum of six kinds of sold Robinia honey 由圖1、圖2、圖3和圖4可看出：在6種市售洋槐蜜中，有4種與洋槐蜜原蜜的峰形、峰位相同，而另外兩種差異較大。采集洋槐蜜原蜜樣品和市售洋槐蜜樣品的主要吸收峰共12 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即相對(duì)應(yīng)的吸收峰及A值 ，進(jìn)行聚類(lèi)分析，如圖5。圖5 洋槐蜜聚類(lèi)分析圖Fig. 5 Graph of dendrograms of Robinia honey IR analysis1 ,2,3,4,5,6 為原蜜 7,8,9,10,11,12為市售洋槐蜜圖6 蒲公英蜜的IR譜圖Fig. 6The IR Spectrum of Taraxaci honey圖7龍眼蜜的IR譜圖Fig. 7 The IR Spectrum of Dimocarpus honey圖8黨參蜜的IR譜圖Fig. 8 The IR Spectrum of Codonopsis honey圖9黃連蜜的IR譜圖Fig. 9 The IR Spectrum of Coptidis honey圖10荊條蜜的IR譜圖Fig. 10 The IR Spectrum of Verbenaceae honey圖11枇杷蜜的IR譜圖Fig. 11 The IR Spectrum of Dimocarpus honey圖12山花蜜的IR譜圖Fig. 12 The IR Spectrum of Cymbidium honey圖13益母草蜜的IR譜圖Fig. 13 The IR Spectrum of Leonurus honey圖14紫云英蜜的IR譜圖 Fig. 14 The IR Spectrum of Astragalus honey 從以上十種蜂蜜的紅外指紋圖譜中可以看出：1722、1651cm-1為黃酮類(lèi)的VC=C產(chǎn)生；1454、1402cm-1的紅外吸收與羧基上的OH有關(guān)；1286cm-1與羧酸的CO振動(dòng)有關(guān); 1114cm-1以及1055cm-1處的一組吸收峰為有機(jī)酸上OH振動(dòng)產(chǎn)生；3439、1031cm-1附近的吸收峰為各種化合物類(lèi)中OH的特征吸收。采集了不同蜂蜜樣品的主要吸收峰共12 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，即相對(duì)應(yīng)的吸收峰及A值 ，進(jìn)行聚類(lèi)分析，因子累積貢獻(xiàn)圖如表1。表1 因子累積貢獻(xiàn)率圖 Tab.1 Graph of Comulative of factorComponent Initial Eigenvalues Total %of VarianceCumulative %15.73047.75147.75123.58829.90277.65331.83115.25792.91040.7065.88498.79459.121E-020.76099.5546783.576E-021.429E-023.415E-030.2980.1192.846E-0299.85299.971100.000 圖15 主成分因子1、2 散點(diǎn)圖Fig. 15 Graph of Scatter plot of principal component，黨參蜜 2黃連蜜荊條蜜 龍膽蜜 紫云英蜜 益母草蜜 7山花蜜蒲公英蜜枇杷蜜 10洋槐蜜圖16主成分因子1、3 散點(diǎn)圖Fig.16 Graph of Scatter plot of principal component，黨參蜜 黃連蜜荊條蜜 龍膽蜜 紫云英蜜益母草蜜 山花蜜蒲公英蜜 枇杷蜜 1洋槐蜜圖17主成分因子2、3 散點(diǎn)圖Fig.17 Graph of Scatter plot of principal component， 黨參蜜 黃連蜜荊條蜜 4龍膽蜜紫云英蜜 益母草蜜 7山花蜜蒲公英蜜 枇杷蜜1洋槐蜜圖18主成分因子1、2、3 散點(diǎn)圖Fig. 18 Graph of Scatter plot of principal component， 黨參蜜 黃連蜜荊條蜜 龍膽蜜紫云英蜜益母草蜜 山花蜜蒲公英蜜枇杷蜜洋槐蜜從聚類(lèi)分析的結(jié)果可以看出，可以把1、2、3、4、6 歸為一組，5、7、8、9、10、11、12 歸為一組，基本上可以把洋槐蜜原蜜和加工的洋槐蜜分開(kāi)，可能是與洋槐蜜加工過(guò)程中添加的某些輔料有關(guān)，只有5為洋槐蜜原蜜，卻歸為加工的洋槐蜜中，具體原因有待于進(jìn)一步研究。4 結(jié)論4.1 十種不同蜂蜜紅外光譜的比較利用紅外光譜法，建立了十種不同蜂蜜的紅外指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析方法，發(fā)現(xiàn)：十種不同的蜂蜜在主成分一，主成分二，主成分三的二維散點(diǎn)圖和三維散點(diǎn)圖上的點(diǎn)都較為分散，說(shuō)明十種不同的蜂蜜在化學(xué)成分上存在一定的差異，這可能是由于不同的蜂蜜的蜜源植物不同造成的。4.2 洋槐原蜜與市售洋槐蜜紅外光譜的比較從六種洋槐原蜜的IR譜圖可以看出，不同部位的紅外吸收峰位基本相同，峰形基本一致，說(shuō)明其中所含的化學(xué)成分及其含量基本相同。從六種市售的洋槐蜜的IR譜圖可以看出，在六種市售的洋槐蜜中，有四種洋槐蜜具有與洋槐原蜜相同的12個(gè)共有峰，但有二種洋槐蜜的吸收峰明顯不同于洋槐蜜原蜜，可能是由于在加工過(guò)程中添加了輔料的因素。參考文獻(xiàn)1 李玉娟，王瑞，車(chē)鎮(zhèn)濤，等. 中藥材指紋圖譜質(zhì)量控制方法研究J. 中藥新藥與臨床藥理, 2001, 12(3): 1921952 任德權(quán). 中藥指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)的意義與作用J. 中藥材, 2001, 24(4): 2352393 謝培山. 色譜指紋圖譜分析是中草藥質(zhì)量控制的可行策略J. 中藥新藥與臨床藥理, 2001, 12(3): 1411424 謝培山. 中藥色譜指紋圖譜M. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004: 2192425 謝培山. 中藥色譜指紋圖譜鑒別的概念、屬性、技術(shù)與應(yīng)用J. 中國(guó)中藥雜志, 2001, 26(10): 6536556 江俊. 中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)新方法中藥指紋圖譜J. 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