分子實(shí)驗(yàn)——影響PCR擴(kuò)增因素的分析.doc

影響PCR擴(kuò)增因素的分析【摘要】聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)問世以來，已經(jīng)在生物學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)得到了巨大的發(fā)展并不斷完善，不僅廣泛應(yīng)用在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，在疾病診斷等方面也有了越來越廣泛深入的研究和應(yīng)用。該反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn),經(jīng)過不斷改良，PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究常用的手段。通過閱讀大量文獻(xiàn)資料，本文對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的基本概念、工作原理以及影響其擴(kuò)增的因素各方面作了概述。【關(guān)鍵詞】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 溫度 引物 Taq DNA聚合酶前言:DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（英文全稱：Polymerase Chain Reaction），簡(jiǎn)稱PCR，又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，其最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是:DNA變性：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。 退火（復(fù)性）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。 延伸：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5端3端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。由以上三個(gè)環(huán)節(jié)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，每一循環(huán)，DNA含量增加一倍，此方法操作簡(jiǎn)便快速，并且非常有效，可在很短的時(shí)間內(nèi)得到數(shù)百萬個(gè)特異DNA序列的拷貝。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA，RNA的地方。目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，如將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。1.引物要擴(kuò)增模板DNA，首先要設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實(shí)際上就是兩段與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，兩引物的5端決定擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)5末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)也就更為重要。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則： 引物長(zhǎng)度根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，長(zhǎng)約17個(gè)堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機(jī)率的為1次。因此，引物長(zhǎng)度一般最低不少于16個(gè)核苷酸，而最高不超過30個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度為2024個(gè)核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72）下不會(huì)形成穩(wěn)定的雜合體。有時(shí)可在5端添加不與模板互補(bǔ)的序列，如限制性酶切位點(diǎn)或啟動(dòng)因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測(cè)等各種目的。 引物擴(kuò)增跨度以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。 引物堿基引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個(gè)引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴(kuò)增片段（G+C）%含量時(shí)宜接近于待擴(kuò)增片段，一般以40%60%為佳，+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，引物之間兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)。特別是在引物3端，即使無法避免，其3端互補(bǔ)堿基也不應(yīng)大于2個(gè)堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer）。所謂引物二聚體實(shí)質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進(jìn)行延伸所形成的與二條引物長(zhǎng)度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時(shí)甚至成為主要產(chǎn)物。 引物3端配對(duì)DNA聚合酶是在引物3端添加單核苷酸，所以引物3端56個(gè)堿基與靶DNA的配對(duì)要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴(kuò)增。 引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。 引物的特異性兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個(gè)以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)模板的同一位點(diǎn)；同樣，引物與待擴(kuò)增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個(gè)以上堿基的同源序列。否則，引物就會(huì)與其它位點(diǎn)結(jié)合，使特異擴(kuò)增減少，非特異擴(kuò)增增加。2.酶及其濃度早在1956年Kornberg等就從大腸桿菌提取液中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶，并且得到了DNA聚合酶純品。DNA聚合酶是由分子量為109000的一條多肽鏈構(gòu)成，此酶可被枯草桿菌蛋白酶分解為兩個(gè)片段，一個(gè)片段分子量為76000，有聚合酶活性，并有35外切酶活力，即Klenow片段（Klenow fragment）。另一個(gè)片段分子量為34000，具有53外切酶活力。因此，DNA聚合酶具有幾種功能：一是聚合作用，以DNA為模板，將dNTP中的脫氧單核苷酸逐個(gè)加到3-OH末端。二是有35外切酶活力，能識(shí)別和消除錯(cuò)配的引物末端，與復(fù)制過程中校正功能有關(guān)。三是53外切酶活力，它能從5端水解核苷酸，還能經(jīng)過幾個(gè)核苷酸起作用，切除錯(cuò)配的核苷酸。1985年Mullis 等發(fā)明了PCR方法，以Klenow片段完成-珠蛋白的PCR后，世界上許多實(shí)驗(yàn)室就考慮用耐熱DNA聚合酶代替Klenow片段進(jìn)行PCR，使耐熱多聚酶的研究得以迅速發(fā)展。PCR反應(yīng)中最常用的DNA聚合酶即Taq DNA聚合酶。用Taq DNA聚合酶代替大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段是使PCR普及應(yīng)用的關(guān)鍵。Klenow片段不能耐受95的雙鏈DNA變性溫度，所以每次循環(huán)都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395的高溫，避免了不斷補(bǔ)加多聚酶的繁瑣操作，同時(shí)使退火和延伸溫度得以提高，減少了非特異性產(chǎn)物和DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)PCR的干擾，增進(jìn)了PCR特異性、產(chǎn)量和敏感度。二者相比，其主要區(qū)別在于：Klenow酶的最適溫度為37，擴(kuò)增的產(chǎn)物并非全是目的序列，需用探針檢測(cè)。Taq酶則不僅產(chǎn)率高而特異性也高。它的最適溫度為7475。因而使退火溫度可以提高，使退火嚴(yán)格性提高，減少錯(cuò)配引物的延伸。循環(huán)后期酶量漸感不足而產(chǎn)生平坡。到達(dá)平玻的循環(huán)次數(shù)，Klenow酶為20個(gè)（均用1g基因組DNA開始）而Taq酶為30個(gè)。延伸片段長(zhǎng)度Taq酶為10kb以內(nèi)，而Klenow酶為400bp以內(nèi)。目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。3.dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。4.模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。5.Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。6.溫度與時(shí)間的設(shè)置在PCR自動(dòng)熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如通常操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：9460s, 3760s, 72120s，共2530個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段500bp。在這里，每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合液達(dá)到所要求的溫度后開始計(jì)算。在自動(dòng)熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時(shí)間需要3060s，這一遲滯時(shí)間的長(zhǎng)短取決于幾個(gè)因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊）以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時(shí)應(yīng)充分給以重視和考慮，對(duì)每一儀器均應(yīng)進(jìn)行實(shí)測(cè)。關(guān)于熱循環(huán)時(shí)間的另一個(gè)重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長(zhǎng)所需的時(shí)間也越長(zhǎng)，前文給出的反應(yīng)時(shí)間是按最適于合成長(zhǎng)度500bp的靶序列擬定的。變性溫度與時(shí)間變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取9095。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過久沒有必要；反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對(duì)照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。引物的復(fù)性溫度也可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta (annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5，可按公式進(jìn)行計(jì)算： Ta = Tm - 5= 4(G+C)+ 2(A+T) -5 其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果（G+C）%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55。在典型的引物濃度時(shí)（如0.2mol/L）,退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長(zhǎng)時(shí)間退火沒有必要。 在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 150 核苷酸/S/酶分子70 60 核苷酸/S/酶分子55 24 核苷酸/S/酶分子高于90時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行 PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075之間，常用溫度為72，在72時(shí)酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達(dá)35100個(gè)核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長(zhǎng)度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序列需34min；擴(kuò)增10Kb 需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。7.循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在2540次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。但實(shí)驗(yàn)過程中，一般的錯(cuò)誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。擴(kuò)增結(jié)束后，樣品冷卻并置4保存。參考文獻(xiàn)1 朱玉賢，李毅編著. 現(xiàn)代分子生物學(xué)，第3版，北京：高等教育出版社，2007.112 魏