細(xì)胞生物學(xué)06核糖體與核酶.doc

第六章.核糖體與核酶 核糖體(ribosome)，是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein particle), 其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈,所以核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。核糖體最早是Albert Claude于20世紀(jì)30年代后期發(fā)現(xiàn)的, 其后又證明了其蛋白質(zhì)合成功能。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展， 核糖體概念的涵意有了進(jìn)一步的發(fā)展。細(xì)胞內(nèi)除了從事蛋白質(zhì)合成的核糖體外， 還有許多其它功能的核糖核蛋白體顆粒， 通常是一些小分子的RNA同蛋白質(zhì)組成的顆粒， 它們參與RNA的加工、RNA的編輯、基因表達(dá)的調(diào)控等。發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)是什么?( 發(fā)現(xiàn)核糖體及核糖體功能鑒定的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)是什么?（答案） 答: 核糖體最早是Albert Claude于1930s后期用暗視野顯微鏡觀察細(xì)胞的勻漿物時(shí)發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)稱(chēng)為微體(Microsomes)，直到1950s中期，George Palade在電子顯微鏡下觀察到這種顆粒的存在。當(dāng)時(shí)George Palade和他的同事研究了多種生物的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中有類(lèi)似的顆粒存在，尤其在進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞中特別多。后來(lái)Philip Siekevitz用亞細(xì)胞組份分離技術(shù)分離了這種顆粒，并發(fā)現(xiàn)這些顆?？偸前殡S內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微粒體一起沉積?；瘜W(xué)分析揭示，這種微粒富含核苷酸，隨之命名為ribosome，主要成分是核糖體RNA(rRNA)， 約占60%、蛋白質(zhì)(r蛋白質(zhì))約占40%。核糖體的蛋白質(zhì)合成功能是通過(guò)放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。將細(xì)胞與放射性標(biāo)記的氨基酸短暫接觸后進(jìn)行勻漿，然后分級(jí)分離，發(fā)現(xiàn)在微粒體部分有大量新合成的放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)。后將微粒體部分進(jìn)一步分離，得到核糖體和膜微粒，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核糖體與蛋白質(zhì)合成有關(guān)。兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)是亞細(xì)胞組份分離技術(shù)和放射性標(biāo)記技術(shù)。)6.1 核糖體的形態(tài)結(jié)構(gòu)核糖體是細(xì)胞內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞器，原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都有核糖體，功能也相同，但是結(jié)構(gòu)組成卻有很大差別。6.1.1 核糖體的類(lèi)型和化學(xué)組成 核糖體的類(lèi)型 按存在的部位:有三種類(lèi)型核糖體，細(xì)胞質(zhì)核糖體、線粒體核糖體、葉綠體核糖體。 按存在的生物類(lèi)型: 分為兩種類(lèi)型，即真核生物核糖體和原核生物核糖體。原核細(xì)胞的核糖體較小， 沉降系數(shù)為70S，相對(duì)分子質(zhì)量為2.5x103 kDa，由50S和30S兩個(gè)亞基組成(圖6-1)；而真核細(xì)胞的核糖體體積較大， 沉降系數(shù)是80S，相對(duì)分子質(zhì)量為3.94.5x103 kDa， 由60S和40S兩個(gè)亞基組成。圖6-1 從兩個(gè)不同角度觀察的E.coli 核糖體的三維結(jié)構(gòu) Mg2+ 的濃度對(duì)于大小亞基的聚合和解離有很大的影響， 體外實(shí)驗(yàn)表明:70S核糖體在Mg2+的濃度小于1mmol/L的溶液中易解離; 當(dāng)Mg2+濃度大于10mmol/L， 兩個(gè)核糖體通常形成100S的二聚體(圖6-2)。圖6-2 通過(guò)區(qū)帶離心鑒定核糖體的亞基在低濃度的Mg2+時(shí)，完整的核糖體將分成大小兩個(gè)亞基。 在組成上，葉綠體中的核糖體與原核生物核糖體相同，但線粒體中核糖體的大小變化較大(表6-1)。表6-1 不同類(lèi)型核糖體的大小比較來(lái)源完整核糖體核糖體亞基核糖體RNAs細(xì)胞質(zhì)80S60S(大亞基)28S，5.8S，5S(真核生物)40S(小亞基)18S，細(xì)胞質(zhì)70S50S(大亞基)23S，5S(原核生物)30S(小亞基)16S線粒體55-60S45S(大亞基)16S(哺乳動(dòng)物)35S(小亞基)12S線粒體75S53S(大亞基)21S(酵母)35S(小亞基)14S線粒體78S60S(大亞基)26S，5S(高等植物)45S(小亞基)18S葉綠體70S50S(大亞基)23S，5S30S(小亞基)16S 核糖體的化學(xué)組成核糖體的大小兩個(gè)亞基都是由核糖體RNAs(rRNAs)和核糖體蛋白(ribosomal proteins)組成的， 原核生物和真核生物細(xì)胞質(zhì)核糖體的大小亞基在蛋白質(zhì)和RNA的組成上都有較大的差別(圖6-3)圖6-3 典型的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞質(zhì)核糖體的化學(xué)組成6.1.2 核糖體蛋白質(zhì)與rRNA由于核糖體有著十分重要的生物學(xué)功能，所以有關(guān)其結(jié)構(gòu)和各種結(jié)構(gòu)域的功能，一直是研究的重點(diǎn)。為了建立一個(gè)完整的核糖體分子結(jié)構(gòu)模型，必須了解構(gòu)成核糖體的每一個(gè)蛋白質(zhì)和rRNA分子在核糖體中的位置。 核糖體蛋白通過(guò)電泳和層析等技術(shù)，已經(jīng)鑒定了E.coli核糖體小亞基的21種蛋白質(zhì)和大亞基的34種蛋白質(zhì)。小亞基的蛋白分別命名為S1S21，大亞基的核糖體蛋白命名為L(zhǎng)1L33。核糖體中的蛋白質(zhì)除了一種具有四個(gè)拷貝外，其余都是一個(gè)拷貝。圖6-4是E.coli小亞基21種蛋白質(zhì)的排列。圖6-4 E.coli小亞基21種蛋白質(zhì)的排列 核糖體rRNAHarry Holler測(cè)定了E.coli 16S rRNA序列，一共有1542個(gè)核苷酸。通過(guò)計(jì)算機(jī)分析，發(fā)現(xiàn)不同生物來(lái)源的16S rRNA的序列組成具有進(jìn)化上的保守性。推測(cè)16S rRNA結(jié)構(gòu)有四個(gè)結(jié)構(gòu)域， 每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有46%的堿基配對(duì)，形成螺旋的柄狀結(jié)構(gòu)(圖6-5)。每一個(gè)柄狀結(jié)構(gòu)都很短，不到8 bp，且并不都是完全配對(duì)的。16S rRNA的電子顯微照片的形態(tài)與30S核糖體亞基相似，因此認(rèn)為30S核糖體亞基的形態(tài)主要是由16S rRNA決定的。圖6-5 E.coli中16S rRNA分子折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊主要是由序列中互補(bǔ)堿基配對(duì)引起的。6.1.3 細(xì)菌核糖體的結(jié)構(gòu)模型為了揭示核糖體的空間結(jié)構(gòu)以及核糖體蛋白質(zhì)和rRNA相互間的關(guān)系，分別用物理、化學(xué)以及顯微技術(shù)進(jìn)行了大量的研究工作，在這些研究工作的基礎(chǔ)上提出了細(xì)菌核糖體的結(jié)構(gòu)模型(圖6-6)。模型中蛋白質(zhì)的定位是根據(jù)不同來(lái)源的資料分析綜合后確定的，如S4、S5、S8和S12等四個(gè)蛋白定位在核糖體的小亞基上，并且是背向大亞基，就是根據(jù)四種不同方法獲得的資料，比較分析后確定的。圖6-6 E.coli 核糖體結(jié)構(gòu)模型圖中分別顯示了小亞基、大亞基中一些核糖體蛋白質(zhì)的位置，以及蛋白質(zhì)合成過(guò)程中mRNA在核糖體中的位置。 在該模型中確定了一些重要的功能區(qū)和RNA的結(jié)合位點(diǎn)(圖6-7)。 圖6-7 核糖體結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)6.2 核糖體的生物發(fā)生(biogenesis)核糖體的合成和裝配過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜。真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的核糖體合成和裝配過(guò)程各不相同。核糖體的生物發(fā)生包括蛋白質(zhì)和rRNA的合成、核糖體亞基的組裝等。6.2.1 核糖體rRNA基因的轉(zhuǎn)錄與加工核糖體的組成成分是蛋白質(zhì)和rRNA，所以編碼核糖體的基因分為兩類(lèi)，一類(lèi)是蛋白質(zhì)基因，另一類(lèi)是rRNA基因。在生活細(xì)胞中，特別是在活躍進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞中，需要大量的核糖體，這就意味著需要合成大量的rRNA和核糖體蛋白質(zhì)。 編碼rRNA基因的過(guò)量擴(kuò)增細(xì)胞為了滿足大量需求的rRNA,通過(guò)兩種方式擴(kuò)大rRNA基因的拷貝數(shù)： 在染色體上增加rRNA基因的拷貝數(shù)，如在細(xì)菌E.coli的基因組中有七套rRNA基因，而典型的真核生物細(xì)胞含有幾百到幾千個(gè)28S、18S和5.8S rRNA基因的拷貝，5S rRNA基因的拷貝數(shù)多達(dá)50000個(gè)。 通過(guò)基因擴(kuò)增(gene amplification)( 細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制DNA, 產(chǎn)生大量的拷貝。如兩棲類(lèi)卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍?；驍U(kuò)增是通過(guò)形成幾千個(gè)核進(jìn)行的，每個(gè)核里含有幾百拷貝的編碼28S、18S和5.8S的rRNA基因，最后卵母細(xì)胞中的這些rRNA基因的拷貝數(shù)幾乎達(dá)到50萬(wàn)個(gè)，而在相同生物的其它類(lèi)型細(xì)胞中，這些rRNA基因的拷貝數(shù)只有幾百個(gè)。卵母細(xì)胞中有如此眾多的rRNA基因拷貝，為卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過(guò)程中合成大量核糖體創(chuàng)造了條件。至于卵母細(xì)胞中rRNA基因擴(kuò)增的機(jī)制，有人認(rèn)為可能是通過(guò)從染色體上分離出來(lái)的環(huán)狀DNA分子，這種環(huán)狀DNA中含有rRNA基因，但是第一個(gè)含有rRNA基因的環(huán)狀DNA是如何形成的尚不清楚。由于環(huán)狀DNA能夠通過(guò)滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)的方式進(jìn)行復(fù)制，因而能夠產(chǎn)生大量的rRNA基因)。科學(xué)家用兩棲類(lèi)的卵細(xì)胞(卵母細(xì)胞)研究在發(fā)育過(guò)程中rRNA基因的擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)兩棲類(lèi)卵母細(xì)胞在發(fā)育的早期，rRNA基因的數(shù)量擴(kuò)增到1000多倍(圖6-8)。圖6-8 非洲爪蟾卵母細(xì)胞中rRNA的合成卵母細(xì)胞中含有幾百個(gè)核仁，每個(gè)核仁都含有擴(kuò)增的rRNA基因。 真核生物18S、5.8S、28S rRNA和5SrRNA基因編碼rRNA基因的DNA稱(chēng)為rDNA。真核生物有四種rRNA基因, 其中18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一起的,每個(gè)基因被間隔區(qū)隔開(kāi), 5S rRNA基因則位于不同染色體上。說(shuō)明人體單倍體染色體組中四種rRNA基因的組成、排列方式和拷貝數(shù)。(說(shuō)明人體單倍體染色體組中四種rRNA基因的組成、排列方式和拷貝數(shù)。（答案） 答: 在人基因組的四種rRNA基因中， 18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一起的，每個(gè)基因被間隔區(qū)隔開(kāi)， 5S的rRNA基因則是編碼在另一條染色體上。前3個(gè)基因組成一組， 分布在人的13、14、15、21、22 等5條染色體上。在間期核中， 所有這5條染色體rRNA基因區(qū)域， 轉(zhuǎn)錄時(shí)聚集在一起， 形成一個(gè)核仁。在人體單倍體染色體組中， 每組rRNA基因有200個(gè)拷貝。每一拷貝為一個(gè)rDNA轉(zhuǎn)錄單位。這3個(gè)基因是縱向串聯(lián)排列在核仁組織者的DNA上。真核細(xì)胞核糖體的5S rRNA基因則是獨(dú)立存在于一個(gè)或幾個(gè)染色體上， 拷貝數(shù)達(dá)幾千個(gè)。在人的細(xì)胞中， 該基因的拷貝有24000個(gè)之多， 它們串聯(lián)排列在1號(hào)染色體接近末端處。) 18S、5.8S、28S rRNA基因轉(zhuǎn)錄與加工 轉(zhuǎn)錄蛋白與45S的前體18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA基因首先轉(zhuǎn)錄成一個(gè)45S的前體rRNA(pre-rRNA)，大約是這3 個(gè)rRNA總長(zhǎng)的2倍。能夠轉(zhuǎn)錄這3個(gè)rRNA前體的DNA區(qū)域稱(chēng)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位(transcription unit)，意指它們有一個(gè)共同的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄單位中除了這三個(gè)rRNA基因外，還包括一些間隔區(qū)。 轉(zhuǎn)錄酶:真核生物中參與rRNA基因轉(zhuǎn)錄的酶是RNA聚合酶。 前體加工前體rRNA在核仁中被酶剪切成3個(gè)rRNA產(chǎn)物， 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)則被降解掉。根據(jù)3H標(biāo)記的尿嘧啶和放線菌素D研究人的培養(yǎng)細(xì)胞前體rRNA的合成的結(jié)果推測(cè)了前體rRNA的加工過(guò)程(圖6-9)。圖6-9 45SrRNA的加工過(guò)程在rRNA聚合酶的作用下，將18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA轉(zhuǎn)錄成45S的前體，然后通過(guò)一系列的切割加工形成成熟的18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。其中5.8S的rRNA通過(guò)互補(bǔ)堿基的氫鍵與28S rRNA結(jié)合在一起。 雖然所有真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因是相同的， 并且在染色體上組成同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位， 但是不同生物中的18S、5.8S和28S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和間隔區(qū)的長(zhǎng)短并不完全相同(圖6-10)。圖6-10 rRNA轉(zhuǎn)錄單位圖的上半部是正在轉(zhuǎn)錄的rDNA形成的刷狀rRNA;下半部是一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄物,并將蛙的rRNA轉(zhuǎn)錄單位與小鼠的轉(zhuǎn)錄單位進(jìn)行比較。從圖中可見(jiàn):基因間被可轉(zhuǎn)錄的間隔物隔開(kāi);轉(zhuǎn)錄單位之間有非轉(zhuǎn)錄區(qū);不同生物的rDNA的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)可能不同;不同生物的rDNA各基因間的間隔序列長(zhǎng)短不同。 由于不同生物的rDNA 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)不同、間隔區(qū)長(zhǎng)短不同，所以 pre-rRNA的長(zhǎng)度不都是45S，范圍在34S45S之間(表6-2)。表6-2 不同種生物的前體rRNA生物pre-rRNA的沉降系數(shù)果蠅34S裂殖酵母37S煙草38S蛙40S雞45S小鼠45S人45S 真核生物前體rRNA的修飾 前體rRNA有兩個(gè)獨(dú)特的特點(diǎn):一是含有大量的甲基化的核苷,另一個(gè)就是具有很多假尿苷(pseudouridine)。在人的前體RNA加工過(guò)程中,有100多個(gè)甲基添加到前體分子的核糖上,并且有95%的尿嘧啶被轉(zhuǎn)變成假尿苷。 前體rRNA的甲基化及其意義:前體rRNA分子中的某些堿基進(jìn)行甲基化修飾，甲基化的主要部位在核糖第二位的羥基上，在甲基化的過(guò)程中需要snRNA的參與。甲基化可能對(duì)加工起引導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)證明前體rRNA中被甲基化的部位在加工過(guò)程中并未被切除，而是一直保持到成熟的rRNA中。另外還發(fā)現(xiàn)，如果人為地阻斷前體rRNA的甲基化，前體rRNA的成熟加工也被阻斷，因此，推測(cè)前體rRNA的甲基化對(duì)rRNA的加工具有指導(dǎo)作用。另外，前體rRNA的修飾可能有利于rRNA的正確折疊，以及與別的分子正確的相互作用。 5S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄與加工5S rRNA是核糖體大亞基的一個(gè)組份，原核生物和真核生物都有5S rRNA，而且結(jié)構(gòu)相似。 5S rRNA基因: 真核生物的5S rRNA基因與其他三種rRNA基因不在同一條染色體上，它是由核仁以外的染色體基因轉(zhuǎn)錄的，然后運(yùn)輸?shù)胶巳蕛?nèi)參與核糖體的裝配。非洲爪蟾的5S rRNA基因的一個(gè)重復(fù)單位含有一個(gè)5SrRNA基因、一個(gè)不轉(zhuǎn)錄的假基因(101bp的5S rRNA基因的片段)，每個(gè)重復(fù)單位間被不轉(zhuǎn)錄的間隔序列隔開(kāi)，間隔序列的長(zhǎng)度變化不定，最長(zhǎng)達(dá)400bp(圖6-11)。圖6-11 非洲爪蟾的5SrRNA基因的組織結(jié)構(gòu) 5S rRNA基因轉(zhuǎn)錄酶: 5S rRNA基因是由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的，原初轉(zhuǎn)錄物的5端與成熟的5S rRNA的5端完全相同。在某些生物中，3端通常含有多余的核苷酸，在加工時(shí)要被切除。所以，5S rRNA只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的加工，或者根本不需要進(jìn)行加工。 內(nèi)部啟動(dòng)子RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄5S rRNA基因時(shí)使用的是內(nèi)部啟動(dòng)子，其他的兩種酶使用的是上游啟動(dòng)子，實(shí)驗(yàn)也證明這種內(nèi)部啟動(dòng)子的存在。如何證明RNA聚合酶進(jìn)行5SrRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí)使用的是內(nèi)部啟動(dòng)子?( 如何證明RNA聚合酶進(jìn)行5S rRNA基因轉(zhuǎn)錄時(shí), 使用的是內(nèi)部啟動(dòng)子?（答案） 播放動(dòng)畫(huà) 答:可通過(guò)基因操作。如將5S rRNA基因的5側(cè)的上游序列完全除去，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄情況, 然后再切去5S rRNA基因的部分內(nèi)部序列,再檢測(cè)轉(zhuǎn)錄情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 將5S rRNA基因的5側(cè)的上游序列完全除去并不影響5S rRNA基因的轉(zhuǎn)錄。但是，如果將5S rRNA基因內(nèi)部缺失一部分序列(從50位到80位缺失)，RNA聚合酶不僅不能轉(zhuǎn)錄這段DNA，甚至不能結(jié)合上去(圖6E-1)。如果將5S rRNA基因的內(nèi)部啟動(dòng)子序列插入到基因組的其它部位，會(huì)使插入的部位形成一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。圖6E-1 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄5S rRNA基因啟動(dòng)子的鑒定將圖中5S rRNA基因的A片段或D片段缺失都不影響RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄,但是將B片段或C片段缺失,都會(huì)影響RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。表明5S rRNA基因的啟動(dòng)子位于5S基因內(nèi)部的控制區(qū)。) 原核生物rRNA基因及轉(zhuǎn)錄原核生物rRNA基因也是多拷貝的，并且也要被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)前體，然后再經(jīng)加工成成熟的rRNA。 原核生物和真核生物的rRNA基因在組織結(jié)構(gòu)的差異 基因的重復(fù)次數(shù): 真核生物的rRNA基因重復(fù)的次數(shù)相當(dāng)高，而原核生物的rRNA基因的重復(fù)次數(shù)卻很少，例如E.coli，只重復(fù)了7次。 真核生物編碼5S rRNA的基因位于不同的染色體上，而細(xì)菌的5S rRNA基因與另外兩種rRNA基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，它們?cè)谌旧w上的排列順序是16S-23S-5S。 轉(zhuǎn)錄: 實(shí)驗(yàn)證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉(zhuǎn)錄的rRNA分子中, 轉(zhuǎn)錄后由核酸酶(RNase)切成三個(gè)分子。如何證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉(zhuǎn)錄的rRNA分子中?( 如何證明原核生物的16S-23S-5S三種rRNA位于同一條轉(zhuǎn)錄的rRNA分子中.（答案） 答:通過(guò)核酸酶(RNase)突變體的研究證明原核生物的三種rRNA位于同一個(gè)原初轉(zhuǎn)錄物中。在這種突變體中，三種rRNA位于同一條rRNA分子中，但是在正常的細(xì)胞中這三種rRNA是以三種獨(dú)立的小分子存在，這一研究結(jié)果也說(shuō)明RNase是將16S-23S-5S rRNA前體切割成單體的主要核酸酶。 在細(xì)菌中RNase不是參與rRNA前體加工的惟一的一種酶，還需要其它一些核酸酶參與，實(shí)驗(yàn)證明如果缺少其它一些酶，得不到正確大小的rRNA。)細(xì)菌中的rRNA轉(zhuǎn)錄單位除了轉(zhuǎn)錄三種rRNA外，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生幾種tRNA分子。在16S和23S rRNA 間可產(chǎn)生12個(gè)tRNA,在5S rRNA基因的下游也會(huì)產(chǎn)生12個(gè)tRNA。同真核生物一樣，細(xì)菌的rRNA也有甲基化，但比真核生物rRNA甲基化程度低。細(xì)菌的rRNA加工過(guò)程示于圖6-12。圖6-12 E.coli前體rRNA的轉(zhuǎn)錄與加工6.2.2 核糖體的裝配核糖體是自我裝配的細(xì)胞器，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和rRNA合成加工成熟之后就要開(kāi)始裝配核糖體的大小兩個(gè)亞基，真核生物核糖體亞基的裝配地點(diǎn)在細(xì)胞核的核仁部位，原核生物核糖體亞基的裝配則在細(xì)胞質(zhì)中。 核糖體亞基的自我裝配 自組裝(self-assembly): 1968年， Masayasu Nomura把拆開(kāi)的大腸桿菌核糖體的30S小亞基的21種蛋白質(zhì)與16S rRNA在體外混合后重新裝配成30S小亞基， 然后把重建的小亞基同50S大亞基以及其他輔助因子混合后， 進(jìn)行蛋白質(zhì)合成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重建的核糖體具有生物活性，能催化氨基酸摻入到蛋白質(zhì)多肽鏈中。這一實(shí)驗(yàn)表明，核糖體是一種自組裝(self-assembly)的結(jié)構(gòu)，即沒(méi)有樣板或親體結(jié)構(gòu)所組成的結(jié)構(gòu)。但是在組裝過(guò)程中，某些蛋白質(zhì)必須首先結(jié)合到rRNA上，其他蛋白才能組裝上去，即組裝過(guò)程有先后層次(圖6-13)。圖6-13 E.coli 小亞基的裝配圖粗箭頭表示結(jié)合力強(qiáng)，細(xì)箭頭表示力弱。如S4與16S rRNA之間是粗箭頭，表示S4可直接與16S rRNA結(jié)合而不需要其他蛋白的存在。而S7與16S rRNA的結(jié)合力很弱，并且需要S4、S8、S9、S19、S20蛋白的存在。 30S亞基蛋白質(zhì)分類(lèi): 在核糖體重裝配過(guò)程中，可以通過(guò)減去某一種蛋白質(zhì)來(lái)驗(yàn)證該蛋白質(zhì)在亞基裝配及亞基中的作用。據(jù)此，可將30S亞基上的蛋白質(zhì)分為三類(lèi):開(kāi)始裝配所必需的蛋白質(zhì)，它們先和rRNA特定區(qū)段結(jié)合，形成核糖體亞基的核心;結(jié)合后可為后一批蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)；非30S亞基形成所必需，但卻是顯示其活性所必需的。 原核生物核糖體重組(ribosome recombination)實(shí)驗(yàn)所謂核糖體重組是指將不同來(lái)源的核糖體大小亞基、或不同亞基的rRNA或蛋白質(zhì)重新組合， 形成雜合的核糖體后研究其功能的實(shí)驗(yàn)方法。有人用核糖體重組實(shí)驗(yàn)得到一些重要的結(jié)論, 請(qǐng)說(shuō)明主要內(nèi)容(有人用核糖體重組實(shí)驗(yàn)得到一些重要的結(jié)論， 你能說(shuō)出一、二嗎?（答案） 答: 這些結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:30S亞基的蛋白質(zhì)專(zhuān)同16S rRNA結(jié)合; 50S 亞基的蛋白質(zhì)只同23S rRNA結(jié)合，如果把30S亞基rRNA和50S 亞基的蛋白質(zhì)相混合，則不能裝配成有功能的亞基。從不同種細(xì)菌提取30S 亞基的rRNA和蛋白質(zhì)， 可裝配成有功能的30S 亞基， 這表明不存在種間差異。原核生物核糖體與真核生物核糖體的亞基彼此不同， 由二者的rRNA和蛋白質(zhì)重組后的核糖體沒(méi)有功能。大腸桿菌的核糖體與玉米葉綠體核糖體亞基重組后具有功能。由于不同生物的線粒體核糖體大小不同， 由55S到80S不等， 而原核生物的核糖體基本穩(wěn)定，所以線粒體的核糖體亞基同原核生物核糖體亞基相互交換形成的雜合核糖體沒(méi)有功能。) 真核生物核糖體在核仁中裝配 主要過(guò)程:圖6-14 是關(guān)于人細(xì)胞中核糖體裝配過(guò)程圖6-14 人細(xì)胞中核糖體裝配的主要過(guò)程20世紀(jì)60年代初期Robert Perry發(fā)現(xiàn)核糖體的合成是在核仁中進(jìn)行的, 請(qǐng)問(wèn)是如何發(fā)現(xiàn)的?( 二十世紀(jì)六十年代初期Robert Perry發(fā)現(xiàn)核糖體的合成是在核仁中進(jìn)行的， 請(qǐng)問(wèn)他是如何發(fā)現(xiàn)的? （答案） 答: 二十世紀(jì)六十年代初期Robert Perry用紫外微光束破壞活細(xì)胞的核仁，發(fā)現(xiàn)破壞了核仁的細(xì)胞喪失合成rRNA的能力，這一發(fā)現(xiàn)提示核仁與核糖體的形成有關(guān)。后來(lái)Perry又發(fā)現(xiàn)低濃度的放線菌素D能夠抑制3H-尿嘧啶摻入rRNA中，而不影響其他種類(lèi)的RNA合成。顯微放射自顯影也顯示放線菌素D能夠選擇性阻止核仁RNA的合成，表明核仁與rRNA的合成有關(guān)。)6.3 核糖體的功能-蛋白質(zhì)的合成核糖體的功能是進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。在核糖體上合成的是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即多肽鏈。合成是從多肽鏈的N端開(kāi)始，到C末端結(jié)束。對(duì)于mRNA來(lái)說(shuō)，合成的方向則是53。蛋白質(zhì)的合成涉及核糖體的一些功能位點(diǎn)和RNA的作用。 6.3.1 核糖體的功能位點(diǎn)原核生物核糖體中有四種與RNA分子結(jié)合的位點(diǎn)，其中一個(gè)是與mRNA結(jié)合的位點(diǎn)，另三個(gè)是與tRNA結(jié)合的位點(diǎn)(圖6-15)。圖6-15 原核生物核糖體中與RNA結(jié)合的位點(diǎn) A位點(diǎn)(A site) (即氨?；稽c(diǎn)，是與新?lián)饺氲陌滨RNA(aminoacyl-tRNA )結(jié)合的位點(diǎn), 又叫受位(entry site)，主要位于大亞基，是接受氨酰tRNA的部位) P位點(diǎn)(P site)( 即肽酰tRNA位點(diǎn)(peptidyl-tRNA site), 又叫供位(donor site), 或肽?；稽c(diǎn), 主要位于大亞基, 是肽基tRNA移交肽鏈后肽酰tRNA所占據(jù)的位置, 即與延伸中的肽酰tRNA結(jié)合位點(diǎn)) E 位點(diǎn)(exit site ，E site)( E位點(diǎn)是脫氨酰tRNA(deaminoacyl-tRNA)離開(kāi)A位點(diǎn)到完全從核糖體釋放出來(lái)的一個(gè)中間?？奎c(diǎn),只是作暫時(shí)的停留。當(dāng)E位點(diǎn)被占據(jù)之后,A位點(diǎn)同氨酰tRNA的親和力降低,防止了氨酰tRNA的結(jié)合,直到核糖體準(zhǔn)備就緒,E位點(diǎn)騰空,才會(huì)接受下一個(gè)氨酰tRNA) mRNA結(jié)合位點(diǎn) 真核生物的mRNA同核糖體的結(jié)合主要靠5端的帽子結(jié)構(gòu)， 有時(shí)也通過(guò)IRES同核糖體結(jié)合(圖6-16);圖6-16 真核生物蛋白質(zhì)合成的起始， IRES是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site)。原核生物mRNA中與核糖體16S rRNA結(jié)合的序列稱(chēng)為SD序列(SD sequence) (圖6-17)。圖6-17 典型的細(xì)菌核糖體與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)mRNA中的SD序列與核糖體16S rRNA3端互補(bǔ)。在SD序列的下游510個(gè)堿基處是起始密碼AUG或GUG。6.3.2 蛋白質(zhì)合成的基本過(guò)程蛋白質(zhì)合成，或稱(chēng)mRNA翻譯是細(xì)胞中最復(fù)雜的合成活動(dòng)。蛋白質(zhì)的合成需要攜帶氨基酸的各種tRNA、核糖體、mRNA、不同功能的蛋白質(zhì)、陽(yáng)離子、GTP等的參與。蛋白質(zhì)合成過(guò)程之所以復(fù)雜，是因?yàn)闃?gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸要按照密碼精確地?fù)饺氲蕉嚯闹?，不能有絲毫的差錯(cuò)。蛋白質(zhì)的合成，是三種不同類(lèi)型的RNA通力合作的結(jié)果(圖6-18)。圖6-18 RNA在蛋白質(zhì)合成中的三種作用 在核糖體上合成多肽鏈，分為三個(gè)完全不同的過(guò)程: 鏈的起始、鏈的延伸、鏈的終止(圖6-19)。圖6-19 蛋白質(zhì)合成的三個(gè)主要過(guò)程 蛋白質(zhì)合成的起始(initiation)蛋白質(zhì)合成的起始涉及到mRNA、起始tRNA和核糖體小亞基之間的相互作用，最后裝配成完整的核糖體，起始過(guò)程分三步完成(圖6-20)。圖6-20 原核生物蛋白質(zhì)合成的起始起始過(guò)程涉及多步反應(yīng)，在原核生物中需要三個(gè)起始因子，在真核生物中涉及多個(gè)起始因子。原核生物蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物形成包括哪些過(guò)程?需要哪些因子參與?( 原核生物蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物形成包括哪些過(guò)程?需要哪些因子參與?（答案） 答: 主要分為三步， 參與的因子包括起始因子1-3，以及mRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)tRNA、GTP等。 30S亞基與mRNA的結(jié)合 mRNA不能與完整的核糖體結(jié)合，但是能夠同獨(dú)立存在的30S核糖體小亞基結(jié)合。在原核生物中，30S核糖體小亞基通過(guò)16S rRNA與mRNA起始密碼子AUG上游的SD序列的互補(bǔ)，從而與mRNA結(jié)合。核糖體小亞基與mRNA的結(jié)合還需要起始因子(initiation factor. IF)的幫助，原核生物的起始因子命名為IFs，真核生物的起始因子命名為eIFs。原核生物有三種起始因子，其中有兩種(IF1、IF3)通過(guò)與30S核糖體亞基的結(jié)合幫助30S亞基與mRNA的識(shí)別與結(jié)合。 第一個(gè)aa-tRNA進(jìn)入核糖體 當(dāng)mRNA與核糖體小亞基結(jié)合后，攜帶甲酰甲硫氨酸的tRNA通過(guò)反密碼子與mRNA中AUG的識(shí)別從而進(jìn)入核糖體。起始tRNA在與mRNA形成mRNA-30S亞基復(fù)合物之前，必須同GTP、起始因子IF2結(jié)合，形成GTP-IF2-tRNAfMet復(fù)合物。起始tRNA復(fù)合物與mRNA的AUG密碼子結(jié)合后，釋放IF3。 完整起始復(fù)合物的裝配 一旦起始tRNA與AUG密碼子結(jié)合，核糖體大亞基就加入到復(fù)合物中形成完整的核糖體-mRNA起始復(fù)合物。該過(guò)程伴隨GTP的水解、IF1和IF2的釋放。其中GTP的水解可能引起核糖體構(gòu)型的變化，而改變了的構(gòu)型正是蛋白質(zhì)合成所必需的。) 多肽鏈的延伸(elongation)一旦起始復(fù)合物形成，蛋白質(zhì)的合成隨即開(kāi)始，此過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)合成的延伸。延伸涉及四個(gè)重復(fù)的步驟氨酰tRNA進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)；肽鍵形成；轉(zhuǎn)位;脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長(zhǎng)。在整個(gè)過(guò)程中，需要GTP和一些延長(zhǎng)因子的參與(圖6-21)。圖6-21 蛋白質(zhì)合成的延伸請(qǐng)?jiān)敿?xì)說(shuō)明多肽鏈延伸的過(guò)程(請(qǐng)?jiān)敿?xì)說(shuō)明多肽鏈延伸的過(guò)程。（答案） 答: 蛋白質(zhì)合成的肽鏈延伸涉及四個(gè)重復(fù)的步驟氨酰tRNA進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)；肽鍵形成；轉(zhuǎn)位;脫氨酰tRNA釋放。上述四步的循環(huán)，使肽鏈不斷延長(zhǎng)。在整個(gè)過(guò)程中，需要GTP和一些延長(zhǎng)因子的參與。氨酰-tRNA進(jìn)入A位 由于起始tRNA占據(jù)P位點(diǎn)，核糖體開(kāi)始接受第二個(gè)氨酰-tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)，此即為延伸的第一步。第二個(gè)氨酰-tRNA在進(jìn)入A位點(diǎn)之前，必須與結(jié)合有GTP的蛋白延伸因子結(jié)合(原核細(xì)胞中延伸因子是Tu，真核生物則是eEF1)。Tu起傳遞作用，即將氨酰-tRNA傳遞給核糖體。雖然任何氨酰-tRNA-Tu-GTP都有可能進(jìn)入A位，但只有反密碼子與A位點(diǎn)密碼子相匹配的tRNA才允許進(jìn)入A位。一旦合適的氨酰-tRNA-Tu-GTP同A位點(diǎn)的密碼子結(jié)合，GTP水解，Tu-GDP被釋放。肽鍵形成 當(dāng)核糖體的P位和A位都有tRNA占據(jù)時(shí)，進(jìn)入核糖體的兩個(gè)氨基酸是分開(kāi)的，所以延伸反應(yīng)的第二步是兩個(gè)氨基酸相互作用，通過(guò)肽鍵的形成將兩個(gè)氨基酸結(jié)合起來(lái)。即由A位的aa-tRNA 上氨基酸的氨基與P位aa-tRNA 上氨基酸的羧基間形成肽鍵， 使P位的tRNA卸去氨基酸，而A位上的tRNA形成了二肽。肽鍵的形成是自動(dòng)發(fā)生的，不需要額外的能量。這一反應(yīng)是由肽酰轉(zhuǎn)移酶(peptidyl transferase)催化的，該酶是核糖體大亞基的組成成份。多年來(lái)一直認(rèn)為肽酰轉(zhuǎn)移酶是組成50S亞基的一種蛋白，現(xiàn)在已經(jīng)清楚，它是構(gòu)成核糖體的RNA，是核酶。轉(zhuǎn)位(translocation) 當(dāng)形成了第一個(gè)肽鍵時(shí)，A位點(diǎn)上的tRNA分子的一端仍然與mRNA的密碼子結(jié)合，而另一端與肽結(jié)合.此時(shí)P位點(diǎn)上的tRNA沒(méi)有氨基酸的結(jié)合。接下來(lái)進(jìn)入延伸反應(yīng)的第三步:轉(zhuǎn)位，即核糖體沿著mRNA從53方向移動(dòng)三個(gè)核苷酸(一個(gè)密碼子)，在此過(guò)程中，A位的tRNA-二肽移到P位，而P位的tRNA則進(jìn)入E位點(diǎn)。轉(zhuǎn)位需要另一個(gè)GTP結(jié)合的延伸因子的參與(原核生物是延伸因子G，真核生物是延伸因子eEF2)。GTP水解釋放的能量轉(zhuǎn)變成機(jī)械能，將核糖體沿著mRNA移動(dòng)大約1 nm。脫氨酰tRNA的釋放 延伸反應(yīng)的最后一步是脫氨酰tRNA離開(kāi)核糖體的E位點(diǎn)。一旦肽酰tRNA轉(zhuǎn)位到P位，A位點(diǎn)再次開(kāi)放，接受下一個(gè)aa-tRNA。在這種情況下，進(jìn)入的氨酰-tRNA的反密碼子必須與第三個(gè)密碼子互補(bǔ)， 開(kāi)始下一個(gè)循環(huán)。在蛋白質(zhì)合成的延伸反應(yīng)中，每一次循環(huán)至少水解兩分子的GTP， 耗時(shí)二十分之一秒，速度之快是驚人的。)在肽鏈延伸過(guò)程中tRNA的轉(zhuǎn)位是如何進(jìn)行的?( 在肽鏈延伸過(guò)程中tRNA的轉(zhuǎn)位是是如何進(jìn)行的?（答案） 答: 通過(guò)足跡法(footprinting)分析，揭示在蛋白質(zhì)合成的延伸循環(huán)中，tRNA的轉(zhuǎn)位是分兩步進(jìn)行的，并且相互獨(dú)立(圖Q6-1)。肽鍵的形成引起新形成的肽酰tRNA大亞基的受體部分從A位向P位偏移，而它的小亞基的反密碼子部分仍然與A位的密碼子相連(此時(shí)的狀態(tài)稱(chēng)為A/P結(jié)合狀態(tài))。新形成脫氨酰tRNA的受體從大亞基的P位向E位偏移，而它的反密碼子部分仍然在小亞基的P位，此時(shí)的狀態(tài)稱(chēng)為P/E結(jié)合狀態(tài)。核糖體與EF-G-tRNA復(fù)合物結(jié)合，引起這些tRNA的反密碼子的末端與它們結(jié)合的mRNA一起相對(duì)于小亞基移動(dòng)，使得肽酰-tRNA完全占據(jù)大、小亞基的P位點(diǎn)(P/P結(jié)合狀態(tài))，而脫氨酰tRNA則完全移到大亞基的E位點(diǎn)。) 終止(termination)蛋白質(zhì)合成的終止是指核糖體沿著mRNA移動(dòng)，如果進(jìn)入A位的是終止密碼子，由于沒(méi)有與之匹配的反密碼子，而終止蛋白質(zhì)的合成。一共有三種終止密碼子:UAA、UAG、UGA，其中任何一種進(jìn)入A位都會(huì)終止蛋白質(zhì)的合成，并導(dǎo)致多肽鏈從核糖體釋放出來(lái)(圖6-22)。圖6-22 蛋白質(zhì)合成的終止原核細(xì)胞使用幾種不同的釋放因子與終止密碼子作用，而真核細(xì)胞中所有的終止密碼子都是與相同的釋放因子作用。6.3.3 多聚核糖體(polyribosomes)在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，同一條mRNA分子能夠同多個(gè)核糖體結(jié)合，同時(shí)合成若干條蛋白質(zhì)多肽鏈，結(jié)合在同一條mRNA上的核糖體就稱(chēng)為多聚核糖體(polysome 或polyribosomes，圖6-23)。 圖6-23 電子顯微鏡觀察的多聚核糖體圖中所示是蠶的絲心蛋白mRNA3端多聚核糖體，箭頭所示是絲心蛋白多肽。 多聚核糖體的發(fā)現(xiàn)20世紀(jì)60年代，有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后發(fā)現(xiàn)了多聚核糖體。如Richs實(shí)驗(yàn)室是用未成熟的紅細(xì)胞研究蛋白質(zhì)合成時(shí)發(fā)現(xiàn)了多聚核糖體。他們將未成熟的紅細(xì)胞與放射性物質(zhì)進(jìn)行短暫培養(yǎng)，以標(biāo)記新合成的蛋白質(zhì)。然后溫和地破碎細(xì)胞，離心除去細(xì)胞核和線粒體，收集上清液，在上清液中含有核糖體。然后通過(guò)移動(dòng)區(qū)帶離心，發(fā)現(xiàn)除了80S的核糖體之外，還有170S的核糖體，而放射性的標(biāo)記物主要存在于170S的核糖體上，因此推斷在蛋白質(zhì)合成時(shí)，核糖體可能是成串存在的。電子顯微鏡觀察證實(shí)：80S的核糖體是單個(gè)存在的，而170S的核糖體是由46個(gè)核糖體組成的多聚核糖體。 多聚核糖體的形成 在mRNA的起始密碼子部位，核糖體亞基裝配成完整的起始復(fù)合物，然后向mRNA的3端移動(dòng)，直到到達(dá)終止密碼子處。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)核糖體離開(kāi)起始密碼子后，空出的起始密碼子的位置足夠與另一個(gè)核糖體結(jié)合時(shí)，第二個(gè)核糖體的小亞基就會(huì)結(jié)合上來(lái)，并裝配成完整的起始復(fù)合物，開(kāi)始蛋白質(zhì)的合成。同樣，第三個(gè)核糖體、第四個(gè)核糖體、依次結(jié)合到mRNA上(圖6-24)。根據(jù)電子顯微照片推算，多聚核糖體中，每個(gè)核糖體間相隔約80個(gè)核苷酸。圖6-24 多聚核糖體的形成與蛋白質(zhì)合成多聚核糖體形成的意義何在?( 多聚核糖體形成的意義何在?（答案） 答: 同一條mRNA被多個(gè)核糖體同時(shí)翻譯成蛋白質(zhì)，大大提高了蛋白質(zhì)合成的速率， 更重要的是減輕了細(xì)胞核的負(fù)荷， 減少了基因的拷貝數(shù)， 也也減輕了細(xì)胞核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄和加工的壓力。)6.3.4 蛋白質(zhì)合成抑制劑不同的蛋白質(zhì)合成抑制劑具有不同的作用方式，是研究蛋白質(zhì)合成機(jī)制的有用工具。 抗生素抗生素(antibiotics)是主要的蛋白質(zhì)合成抑制劑，如氯霉素、鏈霉素等。不同抗生素的作用機(jī)制不同。如鏈霉素主要是抑制起始tRNA和非起始tRNA與核糖體的結(jié)合,導(dǎo)致肽鏈合成的提前終止。有些抗生素抑制50S大亞基肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性,如氯霉素。表6-3是某些常用抗生素的作用。表6-3 某些常用的蛋白質(zhì)合成抑制劑名稱(chēng)作用對(duì)象阻斷過(guò)程影響效果作用的細(xì)胞類(lèi)型氯霉素50S延伸肽鍵形成原核生物大腸桿菌素E330S起始、延伸與mRNA結(jié)合原核生物與氨酰tRNA結(jié)合 放線菌酮60S起始，延伸結(jié)合起始tRNA轉(zhuǎn)位 (tRNA從P位釋放)真核生物白喉毒素eEF-2 延伸轉(zhuǎn)位 真核生物紅霉素50S 起始起始復(fù)合物形成 原核生物梭鏈孢酸EF-G/ eFE-2延伸轉(zhuǎn)位原核/真核生物春日霉素 30S 起始起始tRNA的結(jié)合原核生物嘌呤霉素 50S/60S 延伸肽鍵形成 (觸發(fā)鏈釋放)原核/真核生物壯觀霉素30S 延伸轉(zhuǎn)位原核生物鏈霉素30S 起始，延伸起始tRNA結(jié)合氨酰tRNA結(jié)合 (誘發(fā)錯(cuò)讀)原核生物 四環(huán)素30S 延伸，終止 氨酰tRNA的結(jié)合 RF-1和RF-2的結(jié)合原核生物 紫霉素 50S/30S 阻斷P位點(diǎn)轉(zhuǎn)位原核生物圖6-25 是一些幾種抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素的結(jié)構(gòu)。圖6-25 幾種常見(jiàn)的抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素 嘌呤霉素 結(jié)構(gòu) 嘌呤霉素(puromycin)是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類(lèi)似的結(jié)構(gòu)(圖6-26), 能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合，并摻入到生長(zhǎng)的肽鏈中。圖6-26 嘌呤霉素與苯丙氨酰tRNA3末端結(jié)構(gòu)的比較 對(duì)核糖體功能位點(diǎn)的研究 通過(guò)嘌呤霉素對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)核糖體的A位點(diǎn)和P位點(diǎn)是兩個(gè)獨(dú)立的位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分兩組進(jìn)行，在第一組實(shí)驗(yàn)中，將P位點(diǎn)結(jié)合有起始tRNA的核糖體與嘌呤霉素一起溫育，發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素與核糖體結(jié)合，并且能夠同起始tRNA相互作用。在第二組實(shí)驗(yàn)中，將P位點(diǎn)結(jié)合有起始tRNA的核糖體先與氨酰-tRNA一起溫育，使之形成肽鍵后再加入嘌呤霉素，此時(shí)加入的嘌呤霉素既不能同核糖體結(jié)合也不能與二肽酰tRNA相互作用。但是在反應(yīng)體系中加入GTP和延長(zhǎng)因子EF-G后，嘌呤霉素則又能與核糖體結(jié)合(圖6-27)。圖6-27 用嘌呤霉素證明核糖體的A、P是兩個(gè)獨(dú)立存在的位點(diǎn)根據(jù)這兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果如何判斷核糖體中的A、P是兩個(gè)分開(kāi)的獨(dú)立位點(diǎn)?( 如何根據(jù)嘌呤霉素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果判斷核糖體中的A、P是兩個(gè)分開(kāi)的獨(dú)立位點(diǎn)?（答案） 答: 可以這樣分析:在第一組實(shí)驗(yàn)中，只有起始tRNA占據(jù)P位，如果A位點(diǎn)是一個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)的話，此時(shí)的A位點(diǎn)就是空閑的，嘌呤霉素當(dāng)然能夠結(jié)合上去，如果A位點(diǎn)與P位點(diǎn)是同一位點(diǎn)，那么嘌呤霉素就不能與核糖體結(jié)合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是嘌呤霉素能夠結(jié)合。在第二組實(shí)驗(yàn)中，由于A位點(diǎn)已經(jīng)被二肽酰tRNA占據(jù)，所以嘌呤霉素?zé)o法與A位點(diǎn)結(jié)合，只有加入延伸因子和GTP后，使A位點(diǎn)騰空，嘌呤霉素才能結(jié)合到核糖體上。因此兩根據(jù)這兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以斷定A、P是兩個(gè)獨(dú)立的功能位點(diǎn)。)6.3.5 蛋白質(zhì)的壽命與降解蛋白質(zhì)合成是細(xì)胞中最重要的合成事件。但是，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量的控制不僅和蛋白質(zhì)合成的速度有關(guān)，而且與蛋白質(zhì)的壽命相關(guān)。 蛋白質(zhì)的壽命信號(hào)N-端規(guī)則(N-end rule): 每一種蛋白質(zhì)都有壽命特征， 稱(chēng)為半衰期(half-life)。研究發(fā)現(xiàn)多肽鏈N-端特異的氨基酸與半衰期相關(guān)，稱(chēng)為N-端規(guī)則。表6-4總結(jié)了酵母中的N-端規(guī)則。 表6-4 裂殖酵母中N-端氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)半衰期的影響末端氨基酸殘基半衰期末端氨基端殘基半衰期Arg2 minIle30 min Lys3 minGlu30 min Phe3 minPro5 hr Leu3 minCys30 hr Trp3 minAla30 hr His3 minSer30 hr Asp3 min Thr30 hr Asn3 minGly30 hrTyr10 minVal30 hr Gln10 minMet30 hr 蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解 蛋白酶體(proteasomes)( 蛋白酶體既存在于細(xì)胞核中,又存在于胞質(zhì)溶膠中, 是溶酶體外的蛋白水解體系, 由1020個(gè)不同的亞基組成中空的圓桶形的結(jié)構(gòu),顯示多種肽酶的活性，能夠從堿性、酸性和中性氨基酸的羧基側(cè)水解多種與遍在蛋白連接的蛋白質(zhì)底物。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解是與環(huán)境隔離的。主要降解兩種類(lèi)型的蛋白質(zhì):一類(lèi)是錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),另一類(lèi)就是需要進(jìn)行數(shù)量調(diào)控的蛋白質(zhì)。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解通過(guò)泛素(ubiquitin)介導(dǎo),所以又稱(chēng)為泛素降解途徑。泛素是由76個(gè)氨基酸殘基組成的小肽,它的作用主要是識(shí)別要被降解的蛋白質(zhì),然后將這種蛋白質(zhì)送入蛋白酶體的圓桶中進(jìn)行降解。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用分為兩個(gè)過(guò)程:一是對(duì)被降解的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,由泛素完成;二是蛋白酶解作用,由蛋白酶體催化。蛋白酶體存在于所有真核細(xì)胞中，其活性受干擾素的調(diào)節(jié))蛋白酶體既存在于細(xì)胞核中,又存在于胞質(zhì)溶膠中, 是溶酶體外的蛋白水解體系。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解通過(guò)泛素(ubiquitin)介導(dǎo),故稱(chēng)為泛素降解途徑。蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用分為兩個(gè)過(guò)程:一是對(duì)被降解的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,由泛素完成;二是蛋白酶解作用,由蛋白酶體催化(圖 6-28)。圖6-28 蛋白酶體對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用被降解的蛋白質(zhì)與多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合，從而被標(biāo)記;蛋白質(zhì)-泛素共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物與蛋白酶體頂部的帽子結(jié)合; 泛素被切除，未折疊的蛋白質(zhì)被送入蛋白酶體的腔;-:蛋白質(zhì)在蛋白酶體中被降解。6.4 反義RNA與核酶(ribozyme)在研究真核生物核糖體rRNA加工時(shí)發(fā)現(xiàn)了某些rRNA具有酶的功能，能夠自我剪接，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)一些小分子的反義RNA參與核糖體RNA的修飾。另外還發(fā)現(xiàn)50S核糖體中的23S rRNA具有肽酰轉(zhuǎn)移酶的功能。將具有酶功能的RNA稱(chēng)為核酶。 6.4.1 小分子RNA與反義RNA真核生物中， 除了mRNA，rRNA和tRNA外， 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中含有許多其它類(lèi)型的小分子RNA(small RNA)， 雖然它們的相對(duì)分子質(zhì)量很小， 但卻有非常重要的作用。 小分子RNA的類(lèi)型主要有兩種類(lèi)型的小分子RNA:一類(lèi)是snRNA(small nuclear RNA),存在于細(xì)胞核中；另一類(lèi)是scRNA(small cytoplasmic RNA)，存在于細(xì)胞質(zhì)中。由于snRNA富含尿嘧啶核苷，分類(lèi)時(shí)把它分為U1、U2、等，常見(jiàn)的snRNA的類(lèi)型和功能列于表6-5。表6-5 某些snRNA的特性RNA功能豐度(拷貝數(shù)/細(xì)胞)RNA聚合酶存在于核質(zhì)中U1前體mRNA的剪接1106U2同上5105U4同上2105U5同上2105 U6同上4105U7組蛋白前體mRNA剪接5103U11 功能未知1104U12功能未知51037SK功能未知21058-2前體tRNA的加工(RNase)1105存在于核仁U3前體rRNA的加工2105(植物中則為)U8功能未知4104 U13功能未知11047-2功能未知1105 反義RNA與蛋白質(zhì)合成的抑制 概念: 反義RNA(antisense RNA)是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子, 也包括與其它RNA互補(bǔ)的RNA分子。最早是在E.coli 的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)反義RNA,許多實(shí)驗(yàn)證明在真核生物中也存在反義RNA。近幾年來(lái)通過(guò)人工合成反義RNA的基因, 并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成反義RNA, 即能抑制某特定基因的表達(dá),阻斷該基因的功能, 有助于了解該基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)和分化的作用。 類(lèi)型原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的反義RNA， 根據(jù)其作用方式分為三類(lèi): I類(lèi)、類(lèi)、類(lèi)。根據(jù)原核細(xì)胞中反義RNA作用方式的不同分為三類(lèi)， 請(qǐng)推測(cè)它們的作用方式有什么不同?( 根據(jù)原核細(xì)胞中反義RNA作用方式的不同分為三類(lèi)， 請(qǐng)推測(cè)它們的作用方式有什么不同?（答案） 答: 這三類(lèi)反義RNA的作用特點(diǎn)分別是:I類(lèi)反義RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)， 引起翻譯的直接抑制(1A類(lèi)); 或與靶mRNA結(jié)合后引起該雙鏈RNA分子對(duì)RNA酶的敏感性增加， 使其降解(1B類(lèi))。類(lèi)反義RNA 與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結(jié)合， 從而抑制靶mRNA的翻譯功能，其作用機(jī)理尚不清楚，可能是反義RNA與靶mRNA上游序列結(jié)合后， 會(huì)引起核糖體結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 從而抑制了與核糖體的結(jié)合。類(lèi)反義RNA可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。如tic RNA(transcriptioninhibitory complementary RNA)是大腸桿菌中CAP蛋白(cAMP結(jié)合蛋白)的mRNA的反義RNA。ticRNA基因的啟動(dòng)子可被cAMP-CAP復(fù)合物所激活， 從CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3個(gè)核苷酸處開(kāi)始， 以CAP mRNA的模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈為模板， 合成ticRNA。ticRNA的具體長(zhǎng)度不清楚， 但是它的5端一