實(shí)驗(yàn)四、土壤中放線菌的分離.doc

實(shí)驗(yàn)四、土壤中放線菌的分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、從土壤中分離、純化放線菌；初步掌握藥用微生物的分離純化方法和操作技術(shù)。2、了解不同生境條件中土壤放線菌的種類(lèi)與數(shù)量。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容篩選放線菌永遠(yuǎn)是新抗生素研究的課題之一。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的抗生素約有80%來(lái)自于放線菌。土壤中放線菌最豐富，品種齊全。通常情況下，放線菌在比較干燥、偏堿性、含有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中數(shù)量居多。隨著地理分布、植被及土壤性質(zhì)的不同，放線菌的種類(lèi)、數(shù)量和拮抗性也各不相同。從堆肥或過(guò)熱的材料中如干草或蔗渣中可分離到大量的嗜熱放線菌，從淡水和海洋環(huán)境中可分離到嗜堿性的和嗜酸性的菌種。土壤中含有的放線菌主要是鏈霉菌，人們通常將除鏈霉菌以外的其它放線菌統(tǒng)稱(chēng)為稀有放線菌，如小單孢菌、游動(dòng)放線菌、諾卡氏菌等，它們是生物活性物質(zhì)重要的產(chǎn)生菌。但往往由于樣品中稀有放線菌的數(shù)量太少，常規(guī)的分離方法很難得到。對(duì)樣品進(jìn)行風(fēng)干、干熱處理、培養(yǎng)基添加重鉻酸鉀等方法可以減少細(xì)菌和真菌的數(shù)量，以提高放線菌的獲得率。用干熱和苯酚處理可減少鏈霉菌數(shù)量和比例的方法，可以分離得到更多種類(lèi)的放線菌。土壤中分離放線菌的方法很多，其中包括稀釋法、彈土法、混土法和噴土法等，本實(shí)驗(yàn)主要采用稀釋法來(lái)獲得放線菌。注：從土壤中分出的放線菌要進(jìn)一步鑒別是否為抗生菌。首先應(yīng)根據(jù)篩選目的確定試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，然后利用培養(yǎng)基平板進(jìn)行拮抗性測(cè)定。常用的方法有瓊脂塊法和濾紙片法。其主要依據(jù)是擴(kuò)散原理，即觀察在抗生菌周?chē)欠駮?huì)出現(xiàn)明顯的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度則表明了該菌株抗菌活性的強(qiáng)弱。三、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段原理一：稀釋涂布平板法；如圖1。原理二：對(duì)樣品進(jìn)行風(fēng)干、干熱處理以減少細(xì)菌和真菌的數(shù)量；原理三：向培養(yǎng)基添加適量的重鉻酸鉀能抑制其他細(xì)菌、真菌的生長(zhǎng)，但不影響放線菌的生長(zhǎng)。圖1 稀釋涂平板法示意圖四、實(shí)驗(yàn)組織運(yùn)行要求根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)、要求和具體條件，采用“采用集中授課形式，分組試驗(yàn)進(jìn)行”的組織運(yùn)行模式。五、實(shí)驗(yàn)條件試劑與儀器試劑：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO43H2O、NaCl、FeSO47H2O、MgSO47H2O、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉、pH 試紙、重鉻酸鉀儀器：微波爐、電磁爐、干燥箱、50 或100mL 量筒（滅菌）、玻璃涂鏟（滅菌）、90mm 培養(yǎng)皿（滅菌）、250ml三角瓶（滅菌）、1 或 2mL 移液管（滅菌）、試管（滅菌）、小玻璃珠（滅菌）、標(biāo)簽紙、洗耳球。培養(yǎng)基：高氏1號(hào)合成培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO43H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01 g，MgSO47H2O 0.5 g，pH:7.2-7.4，瓊脂20 g，水1000 mL，分裝，高壓濕熱滅菌。培養(yǎng)基制備過(guò)程：稱(chēng)取一定量可溶性淀粉，放入裝有少量水的小燒杯中，用玻棒將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。再稱(chēng)取其他各成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO47H2O 可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在10ml 水中加入0.1g 的FeSO47H2O 配成0.01g/ml 母液，再在1000ml培養(yǎng)基中加入1ml的0.01g/ml 的貯備液即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積，調(diào)節(jié)pH、分裝、包扎、濕熱滅菌。土樣：從校園各處采樣。要求學(xué)生到不同生境、不同深度土壤中取樣，如：塘泥、森林、苗圃、路邊菜園土或林地土，適量、自然風(fēng)干，待用。六、實(shí)驗(yàn)步驟土樣基本處理：每處理隨機(jī)取不同土壤約100 g，自然條件下風(fēng)干，顏色由深變淺后碾碎，過(guò)孔徑為840 m（20 目）的土壤篩（或人工挑取較大的石?；蛲翂K）。用無(wú)菌的報(bào)紙將土樣包好（單層），放到電熱鼓風(fēng)干燥箱中，60干熱處理1h。（教師在課堂講授前先指導(dǎo)學(xué)生完成該步驟的實(shí)驗(yàn)）倒平板：將裝有滅好菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基的三角瓶直接置于微波爐中加熱溶解（視情況定加熱時(shí)間，注意掌握好加熱的時(shí)間）、冷卻后倒平板，每皿約20 mL。待充分冷卻后用于涂布。稱(chēng)取待測(cè)樣品10.0 g（盛放于滅菌紙中），放入裝有90 mL 無(wú)菌水的250 mL 三角瓶中，充分振蕩10 min，即配成10-1 稀釋度的土懸液；用移液管量取1mL 稀釋度為10-1 的土壤懸浮液于裝有9mL 無(wú)菌水的試管中，充分振蕩，即配成10-2 稀釋度的土壤懸浮液，按此法依次配成10-3，10-4 稀釋度的懸浮液。用平板表面成菌落法測(cè)定土壤中微生物數(shù)量。將配好不同稀釋度（10-2，10-3，10-4）的菌懸液，用無(wú)菌移液管吸取0.2 mL 土壤懸液接種在不同的稀釋度編號(hào)的平板上，每個(gè)處理重復(fù)2 次，用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上均勻涂開(kāi)，每個(gè)稀釋度用一個(gè)刮鏟，如果從低濃度到高濃度涂布，可不用換刮鏟。將涂好的平板置于操作臺(tái)面上2030 min，使菌液充分滲透于培養(yǎng)基內(nèi)，然后將平板倒放，置于28 條件下恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落開(kāi)始計(jì)數(shù)，觀察。每組在每個(gè)濃度兩個(gè)平板分兩種處理：一組無(wú)需向高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入0.5 重鉻酸鉀溶液，直接置于微波爐中加熱溶解、冷卻后倒平板；另一組需向已加熱溶解并冷卻至60高氏一號(hào)培養(yǎng)基中加入1.5 mL 0.5%重鉻酸鉀溶液，充分搖勻后倒平板。七、作業(yè)實(shí)驗(yàn)記錄一、土樣處理步驟 （將之前得到的土樣60干熱處理1h拿到稱(chēng)取待測(cè)樣品10.0 g） （將土樣溶解溶于250 mL 三角瓶中無(wú)菌水中，變渾濁，即得10-1 稀釋度的土懸液）(將10-1稀釋度的土懸液稀釋成 10-2 、10-3 、10-4稀釋度的土懸液，顏色隨濃度降低變淺 )二 倒平板步驟倒平板前的實(shí)驗(yàn)處理將裝有滅好菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基的三角瓶直接置于微波爐中加熱溶解（微波爐中加熱溶解）冷卻后倒平板，每皿約20 mL。（準(zhǔn)備十二個(gè)平板用于分兩組處理情況，一組六個(gè) 每一個(gè)濃度四個(gè)處理。一組為無(wú)重鉻酸鉀處理 一組為添加了重鉻酸鉀1.5 mL 0.5%）倒平板步驟將配好不同稀釋度（10-2，10-3，10-4）的菌懸液，用無(wú)菌移液管吸取0.2 mL 土壤懸液接種在不同的稀釋度編號(hào)的平板上，每個(gè)處理重復(fù)2 次用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上均勻涂開(kāi)，每個(gè)稀釋度用一個(gè)刮鏟（涂布，將不同稀釋度的懸浮液涂布到平板上）將涂好的平板置于操作臺(tái)面上2030 min，使菌液充分滲透于培養(yǎng)基內(nèi)然后將平板倒放，置于28 條件下恒溫培養(yǎng)3天至長(zhǎng)出菌落開(kāi)始計(jì)數(shù)，觀察三土壤中（濕重）放線菌的數(shù)量及培養(yǎng)的特征描述（有重鉻酸鉀10-2 稀釋度）（無(wú)重鉻酸鉀 10-2 ）（有重鉻酸鉀10-3 稀釋度）（無(wú)重鉻酸鉀10-3 稀釋度）（無(wú)重鉻酸鉀10-4 稀釋度）（有重鉻酸鉀10-4 稀釋度）分析與描述1數(shù)量土壤濃度越高的培養(yǎng)基中放線菌的數(shù)量越多，其中中等濃度的放線菌長(zhǎng)勢(shì)最好，而且數(shù)量大約是隨著濃度梯度呈現(xiàn)成倍增加。2外觀與干燥度放線菌的菌落質(zhì)地緊密，表面呈緊密的絨狀，或者堅(jiān)實(shí)，干燥且不易挑起，或者被挑起后不容易破碎。當(dāng)孢子絲形成大量孢子布滿(mǎn)菌落表面時(shí)，使菌落呈現(xiàn)絮狀或者顆粒狀。3無(wú)重鉻酸鉀的培養(yǎng)基 中除放線菌以外還有其他類(lèi)型細(xì)菌的菌落，呈現(xiàn)絮狀 外觀為淺黃色的八、注意事項(xiàng)添加重鉻酸鉀要適量；注意涂平板的方法；3 天和5 天后請(qǐng)記錄觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。九、結(jié)果記錄與分析取平均數(shù)菌液稀釋度放線菌個(gè)數(shù)/（有重鉻酸鉀）放線菌個(gè)數(shù)/（無(wú)重鉻酸鉀）10-260035010-328018010-41020分析1高氏培養(yǎng)基的配制關(guān)鍵是PH值得調(diào)節(jié)和重鉻酸鉀的加入，放線菌最適生長(zhǎng)的溫度是在2327都 PH是7.07.5.而在同樣的條件下也有利于霉菌的生長(zhǎng)。在高溫條件下，放線菌和霉菌都不能被完全殺死，仍可以存活，加入重鉻酸鉀可以抑制霉菌和細(xì)菌的生長(zhǎng)，而對(duì)放線菌不抑制。分析2整個(gè)環(huán)境要在無(wú)菌的條件下進(jìn)行 ，培養(yǎng)基以及實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用的刮鏟，報(bào)紙等等要經(jīng)過(guò)滅菌處理。接種是在火焰區(qū)的無(wú)菌范圍內(nèi)操作，且打開(kāi)培養(yǎng)基的時(shí)間要控制好，補(bǔ)課過(guò)長(zhǎng)。分析3稀釋倒平板法涂布是要均勻，否則，細(xì)菌密度不均將