《培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌》 實(shí)驗(yàn)報(bào)告.doc

. 培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基（以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制為例）的一般方法和原理。2.了解消毒和滅菌的原理，掌握常用滅菌方法的操作步驟。實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中微生物種類繁多，營(yíng)養(yǎng)類型多樣，加之實(shí)驗(yàn)和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因素等。不同微生物對(duì)PH要求不一樣雷菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH一般為中性或微堿性的(嗜堿細(xì)菌和嗜酸細(xì)菌例外)。所以配制培養(yǎng)基時(shí)，都要根據(jù)不同微生物的要求將培養(yǎng)基的pH調(diào)到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物，因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長(zhǎng)繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能道出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的最基本的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長(zhǎng)繁殖之用?；A(chǔ)培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源和維生素，而NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用濃度下96時(shí)溶化，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，一般在沸水浴中或下而墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因此要用稀酸或稀堿將其PH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0g水 1000mlpH 7.47.6實(shí)驗(yàn)儀器與藥品1.溶液或試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1molL NaOH、1molL HCl。2.儀器或其他用具：試管、三角瓶、1000ml燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH 5.5-9.0）、普通棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、麻繩、紗布等。實(shí)驗(yàn)步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備1.稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直接放人水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。2.溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml），用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積（1000ml）；如果配制固體培養(yǎng)基時(shí)，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。3.調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1molLNaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙測(cè)其PH，直至pH達(dá)7.4-7.6。反之，用1molLHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。4.過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。可以省去(本實(shí)驗(yàn)勿需過濾)。5.分裝l 液體分裝分裝高度以試管高度的14左右為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。l 固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的15，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。l 半固體分裝一般以試管高度的13為宜，滅菌后垂直待凝。6.加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞(或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等)，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)面造成污染，并保證有良好的通氣性能(棉塞制作方法附本實(shí)驗(yàn)后面)。7.包扎加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。8.滅菌將上述培養(yǎng)基以0.103MPa，l21，20min高壓蒸氣滅菌。9.擺斜面將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)的一半為宜l0.無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入37的恒溫箱中培養(yǎng)24-48h以撿查滅菌是否徹底。注意事項(xiàng)1.蛋白胨很容易吸濕，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速，另外，稱量時(shí)嚴(yán)防藥品混雜一把牛角匙用于一種藥品或稱取一種藥品后，洗凈擦干再稱職另一藥品瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2.在瓊脂溶化過程中應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。3.對(duì)于有些要求PH較精確的微生物，其PH的調(diào)節(jié)可用酸度計(jì)進(jìn)行(使用方法、可參考有關(guān)說明書)。pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時(shí)若預(yù)先記好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整pH。4.分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污面塞而引起污染。（二）高壓蒸汽滅菌法步驟1.加水使用前在鍋內(nèi)加入適量的水，加水不可過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引起滅菌物積水。水面與三角架相平為宜2.裝料將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。3.加蓋蓋好鍋蓋，按對(duì)稱方法旋緊四周固定螺旋，打開排氣閥。4.加熱排氣加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內(nèi)沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時(shí)，排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，維持23min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)排氣時(shí)間，務(wù)必使空氣充分排除，然后將排氣閥關(guān)閉。5.加壓將排氣閥關(guān)閉6.保壓當(dāng)壓力升至0.1MPa時(shí)，溫度達(dá)121，此時(shí)應(yīng)注意觀察，控制熱源。保持壓力穩(wěn)定，維持20-30min后，切斷熱源。7.自然降壓當(dāng)壓力表降至“0”處，稍停，使溫度繼續(xù)降至100以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋，取出滅菌物。注意：切勿在鍋內(nèi)壓力尚在“0”點(diǎn)以上，溫度也在100以上時(shí)開啟排氣閥，否則會(huì)因壓力驟然降低，而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培養(yǎng)時(shí)引起雜菌污染。壓力降到“0”時(shí)，方可打開排氣閥。8.保養(yǎng) 滅菌完畢取出物品后，將鍋內(nèi)余水倒出，以保持內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥，蓋好鍋蓋。9.培養(yǎng)基無菌檢查五、關(guān)鍵步驟及注意事項(xiàng)1.要嚴(yán)格按配方配制。2.調(diào)pH不要過頭。3.干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時(shí)間控制