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液態(tài)芯片技術(shù) 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 張國軍 1991 年 Foder 等人在 Science 雜志上首次提出生物芯片的概念。 1995 年， Schena 等在 Science 上報(bào)道， 45 個(gè)擬南芥基因固定在一張玻片上檢測表達(dá)，這是第一次生物芯片真正意義上應(yīng)用。 1998 年 , 美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)將生物芯片技術(shù)評為十大科技突破之一。 一、生物芯片的定義和分類 生物芯片是指能快速并行處理多個(gè)生物樣品并對其所包含的各種生物信息進(jìn)行解析的微型器件，它的加工運(yùn)用了微電子工業(yè)中十分成熟的光刻技術(shù)和微機(jī)電系統(tǒng)加工中所采用的各種方法，只是由于其所處理和分析的對象是生物樣品，故稱之為生物芯片。生物芯片能對小分子、生物大分子、細(xì)胞、組織和微小生物等進(jìn)行高通量快速、并行處理和分析。 根據(jù)結(jié)構(gòu)，生物芯片可分為由生物材料微陣列構(gòu)成的芯片和以各種微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的微流控芯片。生物材料微陣列構(gòu)成的芯片包括 DNA 芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片等，其工作原理是抗原抗體結(jié)合、核酸分子的堿基配對的作用，因此也為親和生物芯片；以各種微結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的微流控芯片包括毛細(xì)管電泳芯片、 PCR 的反應(yīng)芯片、介電電泳芯片等。 二、生物芯片概況 電子芯片和生物芯片被稱為 20 世紀(jì)最偉大的兩個(gè)發(fā)現(xiàn)。生物芯片是分子生物學(xué)和信息學(xué)的結(jié)晶。根據(jù)其基材的不同大致可分為玻璃片芯片、膜基芯片、硅基芯片、光纖芯片等。它們的共同的特點(diǎn)是在固態(tài)基材上極小的面積里合成或固定上許多核酸或蛋白探針，使芯片上的每個(gè)或幾個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因或蛋白。利用生物芯片，科學(xué)家們可以通過一個(gè)實(shí)驗(yàn)對成千上萬的基因或蛋白指標(biāo)進(jìn)行分析。生物芯片已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中非常重要的手段。但遺憾的是，這些芯片的致命弱點(diǎn)就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復(fù)性比較差，操作也較繁瑣。正因?yàn)槿绱?，芯片臨床應(yīng)用受到了很大的限制。 美國 Luminex 公司開發(fā)的液態(tài)芯片系統(tǒng)克服了這個(gè)缺點(diǎn)，成為正在崛起的一種標(biāo)準(zhǔn)化的新一代生物芯片技術(shù)平臺，既能為后基因組時(shí)代的科學(xué)研究提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，又能作為高通量的新一代分子診斷技術(shù)平臺在臨床分子診斷領(lǐng)域大顯身手。 三、液態(tài)芯片簡介 美國 Luminex 公司開發(fā)出的液態(tài)芯片技術(shù)平臺是一種全新概念的生物芯片。該技術(shù)的核心是把微小的乳膠顆粒（ 5.6um ）用熒光染色的方法進(jìn)行編碼，每種顏色的微粒（或稱為熒光編碼微粒）代表一種檢測標(biāo)志物。應(yīng)用時(shí)，把針對不同檢測物的彩色編碼微?；旌虾笤偌尤胛⒘坎∪藰?biāo)本，在懸液中靶分子與微粒進(jìn)行特異性地結(jié)合。最后用激光流式儀判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。因?yàn)榉肿与s交或免疫反應(yīng)是在懸浮溶液中進(jìn)行，檢測速度極快，而且可以一個(gè)微量液態(tài)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測 100 個(gè)指標(biāo)。 Luminex 公司稱之為 “xMap” 技術(shù)。該儀器在我國 SFDA 進(jìn)口注冊時(shí)被稱為 “ 多功能流式點(diǎn)陣儀 ” 。 液態(tài)芯片是真正的臨床應(yīng)用型芯片，是基因信息時(shí)代的生物精華。 （一）液態(tài)芯片的概念和特點(diǎn)：液態(tài)芯片技術(shù)是在有色微球、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)及高速數(shù)字信號處理技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種多功能的液相分析平臺。 液態(tài)芯片技術(shù)平臺應(yīng)用非常廣泛，編碼微粒上可以包被蛋白也可以連接核酸，所以液態(tài)芯片既可以用來檢測蛋白（蛋白芯片），也可以檢測核酸變化（基因芯片）。 液態(tài)芯片的特點(diǎn)是高靈敏性，可以達(dá)到 0.01pg ；高通量，適應(yīng) 96 孔板；高重復(fù)性， CV 值小于 5 ；操作簡單。 （二）液態(tài)芯片的原理：如（ ppt13 ）圖片所示，首先 把微小的乳膠顆粒（ Beads, 微球）分別染成不同的（多達(dá) 100 種）熒光色，然后把針對不同檢測物的核酸（互補(bǔ)鏈）或蛋白（如抗原抗體）以共價(jià)方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物（血清中的抗原、抗體、酶或 PCR 產(chǎn)物等），在懸液中的微球與被檢測物特異性地結(jié)合，并加上熒光標(biāo)記。檢測時(shí)，微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性（定性）；另一束測定微球上的熒光標(biāo)記強(qiáng)度從而決定被測物的量（定量）。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。 液態(tài)芯片技術(shù)原理的核心：在聚苯乙烯微球內(nèi)部通過使用 2 種熒光配比染色的方法可以進(jìn)行 100 余種編碼組合；每種熒光編碼微球分別共價(jià)包被特異的基因探針或抗體、抗原、蛋白探針來特異結(jié)合待測樣本中的靶向分子反應(yīng)體系中靶向分子同時(shí)被標(biāo)記上相應(yīng)的報(bào)告熒光；最后通過流式細(xì)胞技術(shù)分離懸浮反應(yīng)體系中編碼微球，并使得單個(gè)的編碼微球依次通過測量區(qū)域；測量區(qū)域是激光和液流交匯之處，報(bào)告熒光物質(zhì)和微球內(nèi)的編碼熒光物質(zhì)分別受到定量激光激發(fā)和定性激光激發(fā)，激發(fā)后光信號轉(zhuǎn)化為電信號；通過計(jì)算機(jī)的分析處理，確定微球結(jié)合的分析物的定性和定量信息。液態(tài)芯片的核心技術(shù)及其機(jī)理圖如（ ppt16-25 ）圖片所示。從而促進(jìn)反應(yīng)體系效率上來講，液態(tài)芯片分子雜交或免疫反應(yīng)在懸浮溶液中進(jìn)行，編碼微球的探針和靶向分子都在懸浮的三維體系中，故反應(yīng)速度和反應(yīng)效率得到最大程度上的提升。所用的時(shí)間縮短到半小時(shí)，靈敏度可達(dá) 0 01Pg 。在特異性方面，激光只分析微球一定半徑內(nèi)的信息，檢測特異性強(qiáng)，背景低?？赏瑫r(shí)得到液體芯片檢測技術(shù)平臺的定性和定量指標(biāo)而無交叉影響。此技術(shù)可開展不同類型的工作，如微生物鑒定、免疫分析、核酸序列研究、酶學(xué)分析、受體和配體識別分析等。與傳統(tǒng)方法相比可極大的提高標(biāo)本利用率，患者的 1 份標(biāo)本可以被用來同時(shí)檢測多達(dá) 100 種生理、病理指標(biāo)。 （三）液態(tài)芯片的優(yōu)點(diǎn)：液態(tài)芯片的獨(dú)特設(shè)計(jì)使得它擁有常規(guī)的檢測方法所不具備的特點(diǎn)。 1. 高效：因?yàn)樵S多顏色的乳膠顆?？梢苑旁谕粋€(gè)反應(yīng)體系內(nèi)，所以一次可同時(shí)檢測多種（ 100 種）生理病理指標(biāo)。這與傳統(tǒng)逐個(gè)檢測的方式效率有很大的不同。 2. 高敏感：每個(gè)乳膠微粒上都以共價(jià)結(jié)合的方式包被上許多抗原、抗體或核酸分子，因其參與反應(yīng)的分子多，產(chǎn)生的信號就強(qiáng)。具 Qiagen 公司的報(bào)道，用該平臺檢測 IL 8 時(shí)，其靈敏度為 0.01pg ，達(dá)到了非常驚人的水平。 3. 快速：因?yàn)殡s交或免疫反應(yīng)在懸浮的液相中進(jìn)行，所以反應(yīng)需要時(shí)間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，所以檢測效率大大高于固相雜交。所用時(shí)間從幾小時(shí)縮短到十幾分鐘。 4. 重復(fù)性好：固相芯片不能很好地應(yīng)用于臨床診斷，其中一個(gè)重要的原因是其重復(fù)性差。這是固液雜交方式的芯片目前難以克服的技術(shù)障礙。但液態(tài)芯片雜交發(fā)生在均相的液體環(huán)境中，其結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性非常好。另外，每個(gè)指標(biāo)在一個(gè)反應(yīng)體系中有 1000 5000 顆相同的微粒。檢測時(shí)，抽取其中的 100 500 顆讀數(shù)，最終的數(shù)據(jù)是取其均值，這樣已經(jīng)把誤差減到最小。相比固相芯片每個(gè)指標(biāo)只有 1 2 個(gè)數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)的可靠性就會(huì)差很多。 5. 唯一被 FDA 批準(zhǔn)用于臨床診斷的生物芯片：具不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有 4 家美國公司基于液態(tài)芯片技術(shù)平臺的產(chǎn)品獲得 FDA 的批準(zhǔn)用于臨床診斷。他們分別是 ZeusScientific 公司開發(fā)的 AtheNAMulti-Lyte 芯片用于自身免疫病 9 種抗體檢測， INOVA 公司開發(fā)的也是應(yīng)用于自身免疫病檢測的液態(tài)芯片， One Lamda 公司和 Lifecode 公司開發(fā)的 HLA 分型液態(tài)芯片 。 四、液態(tài)芯片的應(yīng)用 在液態(tài)芯片平臺上可以開發(fā)許多產(chǎn)品，根據(jù)檢測機(jī)理的不同，可大致分成蛋白芯片和基因芯片兩大類。蛋白芯片基于的原理是抗原抗體的特異性相互作用，它所檢測的目標(biāo)物是蛋白；基因芯片基于的原理是核酸分子雜交，它所檢測的目標(biāo)物是核酸。國外目前有 20 余家公司正在研究基于液態(tài)芯片技術(shù)的產(chǎn)品，涉及的領(lǐng)域主要有 過敏原的篩查、細(xì)胞因子的檢測、腫瘤標(biāo)志物的檢測、感染性疾病的抗原或抗體的檢測、心血管標(biāo)志物的檢測、組織分型以及激酶和磷酸化等。 （一）艾芯：其中 AFP 、 CEA 、 CA125 、 NSE 、 CYFRA211 、 FPSA 、 TPSA 、 FSCG 、 CA242 九個(gè)指標(biāo)只需要 20ul 的血清一次就可以測定出。涵蓋了中國人群高發(fā)腫瘤的 85% ，強(qiáng)調(diào)了對最高發(fā)腫瘤肺癌的指標(biāo)選擇。采用液態(tài)芯片技術(shù)，高效、準(zhǔn)確，節(jié)約了 30% 以上的費(fèi)用和 50% 以上的時(shí)間。艾芯多指標(biāo)檢測平臺被國際上認(rèn)可。剔除了鐵蛋白、 HGH 等指標(biāo)，新增最佳肺癌指標(biāo) cyfra21 1 ，肺癌的檢出率從 50 提高到 90 以上。 （二）肺芯：肺癌為國內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤。肺癌的輔助診斷 4 項(xiàng)組合 CEA 、 CA125 、 NSE 、 Cyfra21-1 為歐洲腫瘤標(biāo)志物組織（ EGTM ）推薦的肺癌黃金組。其中 Cyfra21-1 是肺癌最佳指標(biāo)，單指標(biāo)檢出率大于 65% ，聯(lián)合檢測檢出率提高到 90% 以上。 （三）消芯：消化系統(tǒng)腫瘤占國內(nèi)腫瘤發(fā)病率 50% 以上，針對肝癌、膽囊癌、胰腺癌、食道癌、胃結(jié)腸癌，最精選的 5 個(gè)指標(biāo)為 CEA 、 CA125 、 AFP 、 CA242 、 Cyfra21-1 。其中 Cyfra21-1 也是食道癌最敏感指標(biāo)； CEA 和 CA242 是目前為胃結(jié)腸癌的最佳指標(biāo)組合；新一代的 CA242 比 CA199 在胰腺癌、膽囊癌和消化道癌中假陽性更少。消芯的應(yīng)用，使消化系統(tǒng)腫瘤診斷的準(zhǔn)確率從單指標(biāo)的 30-80% 提高到聯(lián)合檢測的 75-95% 。 （四）婦芯：是針對卵巢癌、宮頸癌、絨毛膜癌、乳腺癌、惡性畸胎瘤等設(shè)計(jì)的一種液態(tài)芯片。包含的指標(biāo)有 CEA 、 CA125 、 AFP 、 Cyfra21-1 和 Free-betaHCG 。其中 CA125 是卵巢癌最佳指標(biāo)，檢出率大于 75% ； AFP 是卵巢內(nèi)胚竇瘤最好指標(biāo)。 Cyfra21-1 在宮頸癌的檢測中比 SCCA 更敏感。 （五） 懸浮微陣列檢測 HPV 基因型 1.HPV 的生物學(xué)性狀及分型： HPV 是一種嗜上皮性病毒，在人和動(dòng)物中廣泛分布。 HPV 感染是當(dāng)前發(fā)病率最高的性傳播疾病之一，可以引起包括外生殖器尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌等多種生殖系統(tǒng)疾病。 HPV 病毒屬于乳多空病毒科，無包膜，直徑 45 55nm ，有 9 個(gè)開放性回讀框架， E1 到 E7 為早期基因轉(zhuǎn)錄區(qū)， L1 和 L2 為晚期基因轉(zhuǎn)錄區(qū)。 HPV 可以分為高危型、可能是高危型或者中危型和低危型，（ ppt40 ）圖片顯示的是各種病變及其對應(yīng)的 HPV 亞型。 2.HPV 與宮頸癌的關(guān)系：約 80 的宮頸癌與高危型 HPV 相關(guān)，其中以 16 ， 18 型呈高度相關(guān)性。 HPV 的感染類型與宮頸癌的組織學(xué)分型有關(guān)， HPVl6 型多見于宮頸鱗癌，而 HPVl8 型則主要見于宮頸腺癌，兩者均與相應(yīng)組織分型的宮頸癌預(yù)后均密切相關(guān)， HPVDNA 陽性者，其預(yù)后相對較差。宮頸癌中 90 以上的病例可以檢測到 HPV 感染， HPV 的檢出率及類型因不同國家和地區(qū)、不同標(biāo)本來源以及不同檢測方法而有所差異。持續(xù)性高危型 HPV 感染是 CIN 進(jìn)展的重要條件，因此，對 HPV 感染進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測可提高宮頸癌前病變篩查的敏感性。 3.HPV 分型懸浮微陣列的優(yōu)點(diǎn)：采用通用引物方法和液態(tài)芯片檢測平臺，一次擴(kuò)增即可以擴(kuò)增多種亞型，一次檢測即可區(qū)分 26 種亞型。靈敏度高，檢測低限僅為 6-10copy/ml ，陽性信號和陰性信號比值高，容易判讀。檢測快，雜交反應(yīng)只需要 15min ，而傳統(tǒng)的雜交方法至少需要 2h ?？?96 孔板操作，適合于大規(guī)模篩查。方法簡單、效率高，敏感度高，特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，適合于大樣本篩查，是最有效最準(zhǔn)確的宮頸癌早期檢測手段。 五、總結(jié) 液相芯片檢測系統(tǒng)具有高通量、靈敏、準(zhǔn)確、簡單、快速、標(biāo)本量少等優(yōu)點(diǎn)，是極具優(yōu)勢的新一代檢測技術(shù)。聯(lián)合檢測多種腫瘤標(biāo)志物的液相芯片克服了傳統(tǒng)免疫檢測方法一次只能檢測一項(xiàng)指標(biāo)的缺點(diǎn)，真正實(shí)現(xiàn)高通量、多樣本的快速檢測，使臨床醫(yī)生和患者全面了解機(jī)體健康狀況，有助于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，提供腫瘤診斷的陽性率、特異性、準(zhǔn)確性，為臨床提供早期診斷治療的依據(jù)。其聯(lián)合檢測中的應(yīng)用模式可歸納為微球編碼、共價(jià)交聯(lián)、結(jié)合反應(yīng)、激光檢測。 在生物科技商業(yè)化的背景下，國外知名大公司紛紛進(jìn)行懸浮芯片的研發(fā)，給臨床醫(yī)學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展帶來新的亮點(diǎn)；同時(shí)在研究方面，給了研究者更大的選擇余地。雖然懸浮芯片在多個(gè)生物醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域中具有明顯的優(yōu)勢，但是在基因表達(dá)譜分析、基因診斷、獲得的基因信息量等方面，仍然無法和傳統(tǒng)的基因芯片相比。懸浮芯片最大的缺點(diǎn)是不能連續(xù)在線監(jiān)測待測樣品中靶標(biāo)物