艾滋病病毒學與致病機理.doc

艾滋病病毒學與致病機理基礎(chǔ)入門問答1、及時發(fā)現(xiàn)并鑒定HIV各種亞型有何重要意義？A、追蹤流行趨勢B、開發(fā)有效的檢測試劑和疫苗C、研制有效的臨床治療藥物2、HIV對下列環(huán)境中的哪些物理因素和化學因素抵抗力較弱？A、高溫B、酒精C、紫外線通常人們對一種疾病的認識總是從癥狀開始，依據(jù)類推比較的原則和體內(nèi)外反復實驗研究，最后明確導致這種疾病的病因。艾滋病也不例外，人們在發(fā)現(xiàn)艾滋病病人數(shù)年后分離出艾滋病病毒(HIV)，二十余年后的今天，HIV是引起艾滋病的病原體已成為一個不爭的事實。艾滋病(AIDS)目前雖然沒有治愈的方法，但已經(jīng)可以通過特異性抗病毒治療改善病人癥狀，延長生命，降低發(fā)病率和死亡率。第一節(jié)艾滋病病毒的分類一、艾滋病病毒“家族”從病毒“大家族”分類來說，HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。HIV自身的家族成員包括HIV-1和HIV-2。HIV-1分為M、O、N亞型組。M亞型組包括A、A2、B、C、D、E、F1、F2、G、H、J、K亞型。O亞型和N亞型很少見。HIV-2主要局限于西部非洲和西歐，北美也有少量報告。HIV-2有A、B、C、D、E、F、C亞型，它的生物學特性與HIV-1相似，但毒力較弱，感染導致的病程較長，癥狀較輕。及時發(fā)現(xiàn)并鑒定HIV各種亞型對于追蹤流行趨勢，準確做出診斷，開發(fā)新的藥物篩選方法和有效的檢測試劑和疫苗，研制有效的臨床治療藥物均具有重要意義。在我國流行的毒株主要是HIV-1，HIV-2僅有個別報道。1999年在福建和上海發(fā)現(xiàn)并證實我國有HIV-2感染者，在華中、華南和西北幾個省區(qū)也有血清學證據(jù)提示可能存在HIV-2感染者。我國HIV-1流行株的分布見表2-1。 二、艾滋病病毒的結(jié)構(gòu)、功能及其臨床意義(一)病毒顆粒HIV呈球形，直徑約100120nm。典型的HIV-1顆粒由核心和包膜兩部分組成，核心包括病毒RNA、核心結(jié)構(gòu)蛋白和病毒復制所必須的酶類。HW的RNA為兩條相同拷貝的正股RNA鏈。病毒復制必須的酶類有3種，分別是逆轉(zhuǎn)錄酶(p66，p51)、整合酶(p32)和蛋白酶(p11)。核酸外面為病毒衣殼蛋白(p24，p17)。病毒的最外層為包膜，其中嵌有g(shù)p120和四41兩種特異性糖蛋白，前者為外膜糖蛋白，后者為跨膜糖蛋白(圖2-1)。 (二)結(jié)構(gòu)基因HIV基因全長約9.8kb，含有g(shù)ag、pol、env3個結(jié)構(gòu)基因、2個調(diào)節(jié)基因和4個輔助基因，分別稱為tat(反式激活因子)、rev(毒粒蛋白表達調(diào)節(jié)子)；ncf(負調(diào)控因子)、vpr(病毒r蛋白)、vpu(病毒u蛋白)和Vif(毒粒感染性因子)。HIV-1的基因結(jié)構(gòu)見圖2-2。(三)臨床意義HIV的結(jié)構(gòu)成分與病毒感染、臨床診斷、藥物、試劑和疫苗的研究密切相關(guān)。如包膜糖蛋白是病毒進入細胞的門戶，針對各種病毒抗原(gp120、gp41、gp24等)而產(chǎn)生的抗體是臨床診斷的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。三、艾滋病病毒在外界環(huán)境中生存能力HIV一旦離開宿主在外界環(huán)境中生存能力便很快消失，HIV對環(huán)境中的物理因素和化學因素抵抗力均較弱，比乙型肝炎病毒(HBV)的抵抗力低的多。因此，對HBV有效的消毒和滅活方法均適用于HIV。(一)HIV對溫度的抵抗力HIV對熱很敏感，對低溫的耐受性強于高溫。因此，可以用高溫滅活HIV，在低溫條件下保存HIV。1. HIV滅活：美國CDC證明干燥環(huán)境中的HIV活性在幾小時內(nèi)降低90%99%。在室溫(2227)液體環(huán)境下HIV可存活15天以上；經(jīng)56處理30分鐘可使HIV在體外對人T淋巴細胞失去感染性，但不能完全滅活血清中的HIV；血清中HIV經(jīng)過603小時或8030分鐘作用后不能檢出感染性HIV。目前，WHO推薦的逆轉(zhuǎn)錄病毒滅活方法是10020分鐘。2. HIV保存：在-70條件下，不加保護劑冷凍，HIV可喪失感染性。若在-70條件下保存于35%山梨醇或50%胎牛血清(FBS)中可存活3個月以上。在液氮中(-196)HIV可存活數(shù)年以上。因此，毒種必須置于液氮中方可長期保存。(二)HIV對化學品的抵抗力1. HIV耐堿不耐酸在pH3.0條件下HIV滴度在10分鐘可下降4個對數(shù)級，而pH值高達9.0時，HIV滴度下降甚微。2. HIV對化學因素很敏感0.5%次氯酸鈉或70%酒精在室溫中，只需1分鐘即不能檢出RT酶活性0.2%次氯酸鈉、0.1%家用漂白粉、0.1%戊二醛、0.5%NP40、0.5%多聚甲醇等5分鐘即可滅活HIV30%酒精溶液5分鐘可滅活HIV20%酒精溶液10分鐘可滅活HIV0.08%氯化氨在10分鐘內(nèi)使HIV滴度降至檢出水平以下0.1%羥丙酸-丙醇(BpL)、1：1000甲醛、50%乙醚、0.5%三硝基甲苯X-100均可使1(104107)感染劑量的制品中HIV全部滅活去垢劑NP40在制備病毒蛋白時常規(guī)使用，HIV對其抵抗力很弱，HIV接觸NP40 1分鐘內(nèi)，其傳染性降低8個對數(shù)級TCID50冷丙酮或甲醛及丙酮標本經(jīng)其固定，可使標本中HIV滅活吐溫20(2.5%)對HIV無滅活作用3.紫外線或丁射線不能滅活HIVHIV對紫外線或射線不敏感，紫外線或射線不能滅活HIV病毒。第二節(jié)艾滋病病毒在人體內(nèi)的復制一、進入易感細胞的途徑(一)易感細胞體外培養(yǎng)表明多種人類細胞對HIV易感，但感染范圍因不同病毒株而不同，見表2-2。一般來說，CD4+細胞可以使HIV復制達到最高滴度。(二)進入易感細胞的通道HIV需借助于易感細胞表面的受體方可進入，包括第一受體(CD4，主要受體)和第二受體(輔助受體)。HIV的外膜糖蛋白gp120首先與第一受體CD4分子結(jié)合，gp120的多個CD4結(jié)合決定簇在結(jié)合時互相影響，使gp120與CD4+結(jié)合時發(fā)生構(gòu)象改變。然后gp120再與第二受體(趨化因子)結(jié)合，使HIV與CD4+細胞進一步靠攏，gp120構(gòu)象進一步改變，并與gp41(gp36)分離，暴露出的gp41(gp36)插入CD4+細胞膜中，最終導致HIV與宿主細胞膜的融合，并釋放病毒內(nèi)容物到CD4+細胞中。HIV胞膜是體液抗體反應(yīng)的主要靶位，胞膜糖蛋白gp120和gp41有很強的抗原性，與抗體中和作用有關(guān)，也是免疫疫苗研究的靶點之一。早期的研究表明HIV通過與宿主細胞表面的CD4分子結(jié)合感染細胞，20世紀90年代后大量的研究證明HIV感染細胞僅靠CD4是不夠的。1996年人們發(fā)現(xiàn)了HIV感染的輔助受體，即HIV與CD4分子結(jié)合后再通過輔助受體方可進入細胞。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與HIV感染有關(guān)的輔助受體有2類，一類是CC型輔助受體，如CCR1、CCR2b、CCR3、CCR5；另一類是CXC型，如CXCR4。輔助受體的發(fā)現(xiàn)為人們進一步從分子水平了解HIV的發(fā)病機制打開了新的通道。至此，HIV生物學特性的研究進入了分子時代。CCR5是最主要的第二受體。第二受體基因在不同人種中遺傳的突變率有明顯差異，缺乏第二受體表達的個體似乎對HIV-1感染有一定的抵抗力。這就是為何有些人反復多次與HIV-1感染者發(fā)生性行為而未感染，或有些HIV-1感染者長達15年以上未出現(xiàn)臨床癥狀，其中有一部分就是具有缺損的CCR5，造成細胞表面CCR5分子減少，從而減低對HIV-1易感性。(三)病毒-細胞融合HIV-1主要通過與宿主細胞膜直接融合進入細胞，而不是通過吞噬作用。HIV-1作用于培養(yǎng)的細胞、無細胞融合現(xiàn)象的毒株稱為NSI型(non-syncytium inducing)；引起細胞融合的毒株稱為SI型(syn-cytium inducing)，表現(xiàn)為合胞體形成。一般SI型與T細胞嗜性有關(guān)，多見于艾滋病患者；NSI型多見于HIV的早期感染者。(四)病毒進入缺乏CD4表達的細胞的機制沒有CD4受體的人體細胞(腦、腸、陰道細胞)也可以感染HIV。HIV是通過這些細胞上半乳糖苷神經(jīng)酰胺(GalC)受體來感染這些細胞的。這個受體是一種糖脂，可結(jié)合在病毒gp120(V3環(huán))的不同區(qū)域，從而細胞被感染。此外，研究發(fā)現(xiàn)HIV還可能通過如MHC相關(guān)分子、淋巴細胞的功能抗原I型(LFA-1)、Fc和補體受體介導等其他機制進入細胞。二、HIV在易感細胞內(nèi)的復制(一)吸附及穿入HIV-1感染人體后，病毒選擇性的吸附于靶細胞的CD4受體上，病毒包膜發(fā)生構(gòu)象改變，外膜糖蛋白gp120的V3區(qū)與宿主細胞的CCR5或CXCR4結(jié)合，引起跨膜糖蛋白gp41區(qū)段與靶細胞膜上的融合結(jié)構(gòu)域發(fā)生融合，使病毒核衣殼穿入宿主細胞。(二)脫衣殼和逆轉(zhuǎn)錄病毒進入細胞后包裹在病毒衣殼內(nèi)的病毒RNA，在與親環(huán)素結(jié)合的衣殼蛋白p24的輔助下出胞。這一過程對環(huán)胞菌素A敏感。緊接著病毒RNA利用自身逆轉(zhuǎn)酶的RNA依賴的DNA聚合酶和RNA酶活性進行逆轉(zhuǎn)錄，最后合成病毒基因組的雙鏈DNA分子(cDNA)。(三)環(huán)化cDNA在環(huán)化酶的作用下形成以共價或非共價結(jié)合的雙鏈環(huán)狀DNA分子。其中非共價結(jié)合的環(huán)狀DNA是整合到宿主染色體上的形式，抗病毒藥對此無效。大多數(shù)新合成的病毒DNA以游離、非整合的共價結(jié)合的環(huán)狀DNA形式保留在細胞漿內(nèi)，它沒有轉(zhuǎn)錄作用，但有致病理變化作用，抗病毒藥對以這種形式存在的病毒有效，可使病毒載量下降。(四)整合在整合酶的作用下，新形成的非共價結(jié)合的雙股DNA整合人宿主細胞染色體DNA中。這種整合的病毒雙股DNA即前病毒。這樣感染就持續(xù)存在。前病毒DNA存在于宿主細胞DNA中，一般沒有病毒蛋白的合成，成為潛伏狀態(tài)，也可以免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。(五)轉(zhuǎn)錄當前病毒被活化而進行自身轉(zhuǎn)錄時，病毒DNA在轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成RNA，一些RNA經(jīng)拼接而成為病毒mRNA；另一些RNA經(jīng)加帽加尾成為病毒的子代基因組RNA。(六)翻譯與裝配病毒利用宿主細胞內(nèi)的核蛋白體，依據(jù)mRNA上各個基因組的遺傳信息翻譯出所需要的各種病毒蛋白，再在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體進行糖化和加工，在蛋白酶作用下裂解，產(chǎn)生子代病毒的蛋白和酶類。Gag蛋白與病毒RNA結(jié)合裝配成核殼體。 (七)病毒體成熟、出芽病毒顆粒通過芽生方式從胞漿膜釋放時獲得病毒體的包膜?？共《局委熆梢灾苯俞槍Σ《緩椭频拿恳粋€步驟，從而可以中斷病毒的復制和傳播。三、病毒生物學特征對病程的影響艾滋病病毒感染過程中，不同個體CD4，細胞數(shù)的下降速率相差很大，從穩(wěn)定的長期不進展狀態(tài)(病程大于10年)到數(shù)年內(nèi)發(fā)展為艾滋病。大量的研究表明病毒與宿主之間的相互作用是決定病程進展的關(guān)鍵因素。自1989年成功地從HIV感染者體內(nèi)分離出HIV以來，人們在實驗室對它的復制特性進行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)從處于不同病程階段感染者血中分離的原代病毒株的復制速率和原代培養(yǎng)中所獲得的病毒量是不同的，提示病毒學因素對于決定病程進展可能是至關(guān)重要的，也就促使人們進一步調(diào)查和研究HIV的生物學特性，如復制速率、致細胞病變特性以及病毒在細胞培養(yǎng)中的嗜性。研究發(fā)現(xiàn)，不僅在不同感染者其病毒的生物學特性不同，病程進展速率不同，SI型病毒感染的個體病程進展較NSI型感染者快。即使在同一個體病程進展過程中，其病毒的生物學特性也會有所改變，可由病程早期的NSI型轉(zhuǎn)變?yōu)橥砥诘腟I型。正如HIV的基因會時常發(fā)生變異一樣，病毒對輔助受體的利用也在不斷的變化中，研究表明在病程的早期HIV進入細胞所利用的受體是R5受體，隨著病程的進展、宿主細胞識別HIV能力的增強和HIV自身為在宿主細胞內(nèi)播散及更不受阻的進入細胞而會出現(xiàn)受體利用轉(zhuǎn)移，如利用RSX4或R3RSX4受體。這些變化的物質(zhì)基礎(chǔ)是基因的變異，結(jié)果尚不明確但可以想象的是HIV在體內(nèi)不被清除反而毒性加強，藥物受體抑制劑的作用不顯著。第三節(jié)艾滋病病毒感染導致的人體變化及最終結(jié)局一、HIV感染導致的人體變化 人體感染HIV后，即開始了病毒試圖在體內(nèi)生存，機體免疫反應(yīng)試圖清除病毒的兩種力量的持續(xù)較量。在沒有任何有效治療的情況下，數(shù)年或十數(shù)年后病毒將戰(zhàn)勝機體，病人死亡。(一)病毒在體內(nèi)的復制HIV在人體內(nèi)的半衰期為2天，每天產(chǎn)生或清除的病毒量平均約為109。病毒在體內(nèi)快速復制、播散、破壞細胞，最終戰(zhàn)勝免疫系統(tǒng)的抵抗，使機體衰竭。按照病毒復制過程和各個階段的主要特征將病毒在體內(nèi)的動態(tài)分為以下幾個期：1.體內(nèi)播散期病毒進人體內(nèi)在2天內(nèi)到達局部淋巴結(jié)，5天內(nèi)進入血液循環(huán)。其結(jié)果是導致全身性播散，到達腦部和淋巴組織。2.原發(fā)HIV感染期從暴露于HIV到出現(xiàn)癥狀的時間一般是24周，但是在少數(shù)病例可長達10個月。在急性感染的數(shù)天內(nèi)，淋巴結(jié)內(nèi)被激活的淋巴細胞中出現(xiàn)高水平的病毒復制，在很短的幾天內(nèi)出現(xiàn)P24抗原血癥和高滴度病毒血癥，每毫升血漿中可檢出107個病毒RNA分子。CD8+細胞計數(shù)上升，并伴有短暫的CD4、細胞計數(shù)下降。隨著特異性體液免疫應(yīng)答的出現(xiàn)，病毒血癥減輕，突變病毒出現(xiàn)，病毒成為異質(zhì)群體。免疫應(yīng)答出現(xiàn)后，血漿中HIVRNA的滴度會下降23個對數(shù)級，急性HIV感染的癥狀也會消失。3.血清轉(zhuǎn)換期用標準第三代EIA試劑檢測，通常3周發(fā)生HIV抗體陽轉(zhuǎn)。從HIV感染到產(chǎn)生抗體(或血清抗體陽轉(zhuǎn))稱為“窗口期”，95%的HIV抗體都發(fā)生在感染后的5.8個月，故一般認為窗口期為6個月?！癏IV感染早期”的定義為血清抗體陽轉(zhuǎn)和HIV感染6個月之間的階段。6個月時病毒載量達到一個“固定值”，如果不進行抗病毒治療，幾年內(nèi)不會有很大變化。這個固定值和預(yù)后有很大關(guān)系。早期治療的目標之一是重新設(shè)定固定值，使固定值保持較低水平。臨床上的急性感染期包括了HIV在體內(nèi)的這三個階段，回顧性的調(diào)查發(fā)現(xiàn)非典型的癥狀如：發(fā)熱、疲乏、咽炎、頭痛、腹瀉、口腔、食管或生殖器黏膜潰瘍、關(guān)節(jié)痛等會出現(xiàn)。4.無癥狀感染期這個時期病人無臨床癥狀，體檢時無異常，少數(shù)可查到“持續(xù)性全身性淋巴腺病”(PGL)，定義為腫大的淋巴結(jié)至少發(fā)生在兩處且不是腹股溝淋巴結(jié)。這個時期由于細胞外的病毒被濾泡樹突狀細胞(FDC)捕捉而進人生發(fā)中心，細胞內(nèi)的病毒大部分處于潛伏狀態(tài)，所以淋巴結(jié)中病毒濃度很高。這個時期淋巴組織是病毒的主要藏身處，外周血中的病毒載量相對不高，隨著疾病的進程，淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)被破壞，更多的病毒釋放出來。此期相當于臨床病程的潛伏期，上述的不典型癥狀很快消失，患者無臨床癥狀出現(xiàn)。5.艾滋病前期(“ARC”或“B期”)B期癥狀包括被HIV感染后更常見更嚴重的癥狀，但還不是艾滋病的典型癥狀。此期也即臨床的艾滋病相關(guān)綜合征期，癥狀包括被HIV感染后更常見、更嚴重的癥狀，但還不是艾滋病的典型癥狀。常見并發(fā)癥包括鵝口瘡、口腔毛狀黏膜白斑病、末梢神經(jīng)紊亂、子宮頸上皮腫瘤、全身性癥狀(發(fā)熱、體重減輕)、復發(fā)性帶狀皰疹、特發(fā)性血小板減少性紫癜和李斯特菌病。6.艾滋病期當患者出現(xiàn)典型癥狀時，CD4+細胞計數(shù)通常降至200個/l以下，血和淋巴結(jié)中的病毒載量又上升到相當高的水平，同時抗病毒CD8+細胞反應(yīng)減弱。在艾滋病期病人血液中的HIV群體又一次變得相當均一，通常是細胞融合(SI)表型為主，與T細胞嗜性有關(guān)。7.艾滋病晚期這個時期指CD4+計數(shù)50個/l的病人，若不經(jīng)治療平均存活期是1218個月。此即真正意義上的艾滋病(AIDS)期，此期一系列的指征性疾病會在不同的患者身上出現(xiàn)，包括：浸潤性宮頸癌、食道、氣管、支氣管或肺念珠菌病、彌漫性或肺外球孢子菌病、肺外隱球菌病、HIV相關(guān)癡呆癥、伯基特淋巴瘤、HIV相關(guān)的消瘦等等，最后的結(jié)局是患者死于并發(fā)癥。 在這些不同的臨床階段，病毒群依次經(jīng)歷均一性到異質(zhì)性，又恢復到均一性等特征。晚期病毒以SI表型為主的特征與在宿主中的毒力有關(guān)。二、HIV感染的三種臨床結(jié)局(一)典型進展者在感染早期，其免疫功能未受損害，但在810年內(nèi)免疫控制能力逐漸下降，最后發(fā)展成為艾滋病。(二)快速進展者這個群體的CD4+細胞計數(shù)在25年內(nèi)迅速下降，抗HIV的抗體水平很低，而且該抗體中和HIV的能力也較差，也可能有增強抗體。快速進展者中最顯著的特征是HIV感染后一直維持較高的病毒載量，而且分離的HIV有均一性。(三)長期存活者(又稱長期不進展者)這些感染者能維持健康狀態(tài)12年以上，并且CD4+細胞計數(shù)維持正常。這些長期存活者在所有感染者中的比例一般在8%10%，目前最長已達17年。這些無癥狀者可在血友病患者、靜脈吸毒者、異性接觸者和新生兒中發(fā)現(xiàn)。長期存活者常常具有如下特征：病毒載量低(血漿和PBMC)、HIV毒株是相對非致病性毒株、針對個體中現(xiàn)存HIV毒株的抗體不會加重感染、PBMC產(chǎn)生I型細胞因子、CD8+細胞抗病毒反應(yīng)很強。三、能否從體內(nèi)徹底清除艾滋病病毒HIV整合至宿主細胞染色體及其高度變異特性為其在宿主體內(nèi)長期生存奠定了基礎(chǔ)。H