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bi1短發(fā)夾狀RNA重組真核表達質(zhì)粒對鼻咽癌和卵巢癌細胞增殖的影響作者：張美紅單位：廣東湛江, 廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所【摘要】 目的 以真核表達質(zhì)粒pmU6為基礎，針對bi1基因構建在細胞內(nèi)表達短發(fā)夾狀 RNA (shRNA) 的質(zhì)粒載體，并觀察它們對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細胞株生長增殖的影響。方法 人工合成bi1寡核苷酸鏈，退火、定向克隆入pmU6載體中產(chǎn)生重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉染到細胞中，MTT比色法觀察轉染試劑及質(zhì)粒載體對細胞生長增殖的影響。結果 與未處理組相比，bi1shRNA對CNE2Z、CNE1、HO8910PM細胞株的生長增殖有明顯的抑制作用，而對HO8910細胞株的生長增殖無明顯抑制作用。結論 重組質(zhì)粒能在細胞內(nèi)表達shRNA，產(chǎn)生RNA干擾(RNA interference, RNAi)效應并特異性抑制靶細胞的生長增殖，為質(zhì)粒介導的RNAi技術應用于鼻咽癌和卵巢癌的基因治療提供一定的理論依據(jù)。 【關鍵詞】 RNAi 基因轉染 bi1 RNAi 指在生物體細胞內(nèi)，外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA (doublestranded RNA, dsRNA)啟動并介導與其同源mRNA的特異性降解，從而抑制相應基因表達的過程1。在RNAi過程中，細胞內(nèi)小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的來源有不同的形式，以siRNA表達載體(質(zhì)粒或病毒載體)法的應用最為廣泛。本研究以真核表達質(zhì)粒pmU6為基礎，針對bi1基因的5個不同位點設計并構建shRNA表達質(zhì)粒，以期在腫瘤細胞內(nèi)表達siRNA，并觀察bi1shRNA表達質(zhì)粒在兩種腫瘤細胞內(nèi)介導的RNAi效應對靶細胞生長增殖的影響。 1 材料和方法 1.1 菌株、細胞株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α自衛(wèi)生部武漢生物制品研究所引進；鼻咽癌低分化上皮細胞株CNE2Z、鼻咽癌高分化上皮細胞株CNE1、高轉移卵巢漿液性囊腺癌細胞株HO8910PM細胞株、卵巢漿液性囊腺癌細胞株HO8910自上海細胞生物所引進；pmU6質(zhì)粒由本課題組構建并保存2。 1.2 試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基和小牛血清購于美國Gibco公司；脂質(zhì)體(Lipofectmine TM2000)購于Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；工具酶購于新英格蘭生物公司(NEB)和華美生物工程公司；四氮唑藍(MTT)購于SinoAmerican Biotechnology公司；酶標儀為美國BioRad公司產(chǎn)品；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。 1.3 表達bi1shRNA載體的構建及鑒定 根據(jù)Reynolds等3的原則進行siRNA序列的設計，從人bi1基因 (gi:23271 944)序列中選擇Position: 212238、Position: 350376、Position: 573599、Position: 735761四個位點 (因bi1的CDS為141854)，分別命名為bi11、bi12、bi13、bi14，相應的重組質(zhì)粒命名為pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6 bi14；同時設計一個陰性對照siRNA序列，命名為bi1s，相應的重組質(zhì)粒命名pmU6bi1s。候選bi1 siRNA序列需要經(jīng)過GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST分析。siRNA序列只列出正鏈序列：bi11 (27nt)正義鏈：5′GCAGCACCTGAAGAAGGTCTATGCAAG3′；bi12 (27nt)正義鏈：5′GCTGATGGCAACACCTCATAGCCATGA3′；bi13(27nt) 正義鏈：5′GGTATCTTGATGTCAGCCCTGAGCTTG3′；bi14 (27nt) 正義鏈：5′GGAGATCAAGATTATATCTGGCACTGC3′；bi1s (27nt) 正義鏈：5′GGTATCTTGATGTGCCACCTGAGCTTG3′。表達shRNA的轉錄模板是由9bp的連接片段將siRNA序列的正義鏈(27nt)和反義鏈(27nt)連接而成的反向重復序列，5對shRNA轉錄模板序列由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。 將各shRNA轉錄模板退火后，與Bbs酶切后的pmU6大片段進行定向重組，然后轉化，篩選陽性克隆。小量提取陽性克隆菌質(zhì)粒DNA后直接進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；另各取1μg質(zhì)粒DNA進行PCR擴增，pmU6上游引物：5′CGACACGGAAATGTTGAA3′；pmU6下游引物：5′AGGGAAGAAAGCGAAAGGA3′。PCR擴增參數(shù)為94 3min，94 40s、52 90s、72 1min，共30個循環(huán)，最后72延伸7min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，將經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定正確的陽性克隆菌進行測序鑒定。 1.4 細胞培養(yǎng)及轉染 將CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，取對數(shù)生長期細胞用于實驗，按照轉染試劑操作手冊進行轉染實驗4。 1.5 MTT比色法檢測細胞的生長抑制率 實驗設未處理組、Lip (脂質(zhì)體)組、pmU6質(zhì)粒對照組、各重組干擾質(zhì)粒組。各組的質(zhì)粒濃度為2mg/L(0.2μg/孔)；Lip組按轉染相應濃度質(zhì)粒所需用量設計其終濃度。轉染48h后，每孔加入10g/L MTT 10μl，培養(yǎng)4h后，加二甲基亞砜100μl，測定波長570nm和630nm處的吸光度A值。每組設4個平行孔，結果取平均值，重復3次實驗。按以下公式計算細胞生長抑制率：抑制率(%) = (1實驗孔A值/對照孔A值)×100 %。 1.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗。P>0.05為差異無統(tǒng)計學意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。 2 結果 2.1 表達bi1 shRNA重組質(zhì)粒的鑒定 將提取的質(zhì)粒進行1%普通瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。電泳結果與理論值 (質(zhì)粒pmU6為4 856bp，質(zhì)粒pmU6bi11、pmU6bi12、pmU6bi13、pmU6bi14和pmU6bi1s均為4 614bp)相符。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物，結果見圖2。各重組質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物為752bp，而質(zhì)粒pmU6的PCR擴增產(chǎn)物為994bp，電泳結果與理論值相符。 2.2 各重組質(zhì)粒表達的bi1 shRNA對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細胞生長增殖的影響 為了觀察針對bi1設計的siRNA序列對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細胞株的抑制效率，我們用上述重組質(zhì)粒對CNE2Z、CNE1、HO8910PM、HO8910細胞株進行轉染實驗，MTT結果見表14。表1 脂質(zhì)體介導的重組質(zhì)粒對CNE2Z細胞生長抑制作用3 討論 RNAi是由dsRNA介導的同源mRNA特異性降解現(xiàn)象。目前RNAi作為一種新的反向遺傳學手段引起了人們的廣泛關注，自2001年Tuschl首先成功地將RNAi技術用于哺乳動物細胞起5，RNAi不但被應用于哺乳動物細胞的基因功能分析，還被廣泛用于腫瘤的基因治療。 本文所選擇的靶基因bi1是近年發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，不屬于與程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)有關的任何基因家族，是少數(shù)幾種同時存在于動物和植物中的保守性細胞死亡抑制因子之一；在動物中，bi1是受bcl2和bax調(diào)控的細胞死亡通路上的新型調(diào)節(jié)因子。與相應的正常細胞相比，bi1在前列腺癌6、原發(fā)性乳腺癌7, 8細胞中的表達上調(diào)4倍到10倍；另外，在子宮癌、卵巢癌和肺腺癌細胞9中也發(fā)現(xiàn)bi1基因表達的上調(diào)，這些表明，bi1基因的過表達可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。運用RNAi技術阻抑bi1基因在人前列腺癌、原發(fā)性乳腺癌中的表達, 已獲得了誘導腫瘤細胞凋亡的滿意結果，故bi1有望成為這些腫瘤潛在的預后標志。文獻報道8，bi1在某些腫瘤細胞中的表達不依賴于腫瘤細胞的分化程度。據(jù)已檢索到的文獻，迄今國內(nèi)尚無通過阻抑bi1基因表達誘導腫瘤細胞凋亡的相關研究報道，故本研究選擇具有不同分化程度的鼻咽癌細胞和具有不同轉移潛能的卵巢癌細胞進行初步的研究。 本研究構建的質(zhì)粒載體可在細胞內(nèi)表達針對bi1的shRNA，shRNA在細胞內(nèi)酶的作用下可迅速形成siRNA10，故可觀察它們在不同腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生的RNAi效應對細胞生長增殖的影響。在mU6啟動子作用下，重組質(zhì)粒所表達的shRNA如圖3(只列出pmU6bi11重組質(zhì)粒表達的shRNA，其他類似)。 本課題組經(jīng)實驗證實CNE2Z和CNE1細胞中均有bi1基因的表達且表達量的差異無統(tǒng)計學意義。把表達bi1 shRNA的質(zhì)粒轉染至CNE2Z、CNE1細胞中，發(fā)現(xiàn)針對bi1的不同siRNA序列對CNE2Z、CNE1細胞生長增殖均有較強的抑制作用。統(tǒng)計學分析表明，通過阻抑bi1基因表達對鼻咽癌細胞生長增殖的影響并不依賴于鼻咽癌細胞的分化程度，故初步推測：利用RNAi技術阻抑bi1基因表達抑制鼻咽癌細胞生長增殖進而誘導鼻咽癌細胞凋亡的過程中，CNE2Z和CNE1細胞發(fā)生凋亡的機制可能是相同或相似的，具體的機制有待于進一步的研究。 本課題組經(jīng)實驗證實HO8910PM和HO8910細胞中也有bi1基因的表達且表達量的差異無統(tǒng)計學意義。當轉染表達bi1 shRNA的干擾質(zhì)粒至HO8910PM 和HO8910細胞中時，發(fā)現(xiàn)它們對HO8910PM的生長增殖均有較強抑制作用，而對HO8910細胞的生長增殖無明顯抑制作用。腫瘤細胞的生長、增殖、分裂與細胞周期的調(diào)控密切相關，一些基因及其產(chǎn)物如p53、p21、Cyclin D1、PCNA 等是細胞周期調(diào)控中重要的調(diào)控因子11。由于HO8910PM和HO8910細胞在癌基因和抑癌基因、轉移基因和抑轉移基因、凋亡基因和存活基因等的表達上存在差異12： HO8910PM細胞中，p21、Cyclin D1、CD44V6、凋亡連接基因2(ALG2)13、突變型p53、EGFR等的表達強度大于HO8910細胞； HO8910PM細胞中，nm23、p16的表達強度弱于HO8910細胞，所以，這兩株細胞在生長、增殖等過程中具有各自的生物學特征。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個多基因參與，經(jīng)過多階段協(xié)同作用的結果，某一基因的變化僅僅影響腫瘤一定階段的某些生物學特征。本文通過阻抑bi1一個基因表達，觀察到對HO8910PM和HO8910細胞生長增殖影響的差異，可能與這兩株具有不同轉移潛能的卵巢癌細胞中蛋白表達存在明顯差異有關，具體機制還有待進一步地研究與探討?！緟⒖嘉墨I】 1 Mccaffrey AP, Meuse L, Pham TT, et al. 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