原創(chuàng)論文 益生菌耐藥性研究進(jìn)展.doc

益生菌耐藥性研究進(jìn)展摘 要：益生菌對(duì)人類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)和健康有著非常重要的意義，在食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中都有廣泛的應(yīng)用。本文綜述了若干益生菌耐藥性的研究進(jìn)展，對(duì)從事益生菌研究的科技工作者具有一定的參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：益生菌；作用機(jī)理；耐藥性；研究進(jìn)展The Research Progresses on Antimicrobial Susceptibility of ProbioticsAbstract: Probiotics take an important part in human nutrition and health. Also, it used widely in food, medicine and feed industry. This paper summarizes some research progresses on antimicrobial susceptibility of probiotics, which will be helpful to the researchers who engage in antimicrobial susceptibility of probiotics.Key words: probiotics; mechanism of action; resistance; research progress近年來(lái)，關(guān)于益生菌對(duì)促進(jìn)人類(lèi)健康的研究越來(lái)越多，我們對(duì)益生菌的了解也越來(lái)越透徹，有關(guān)益生菌耐藥性的報(bào)道也時(shí)常見(jiàn)諸國(guó)內(nèi)外各大主流科研學(xué)術(shù)期刊，但其研究還有待深入。為此，本人綜述了益生菌耐藥性的研究進(jìn)展，以圖揭開(kāi)益生菌耐藥性的神秘面紗。1 益生菌簡(jiǎn)介1.1 概念和種類(lèi)根據(jù)有關(guān)研究人員的定義，認(rèn)為益生菌是指一類(lèi)通過(guò)添加到食品或藥品中，能夠起到調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，從而對(duì)人或動(dòng)物產(chǎn)生有利影響的微生物1。作為益生菌應(yīng)具備以下條件：(1)安全，即無(wú)毒性和非致病性；(2)具有耐受腸道膽汁和胃酸的能力，可在消化道內(nèi)定植；(3)對(duì)宿主有益，有抗菌作用；(4)生長(zhǎng)條件不苛刻，產(chǎn)品中活菌濃度高，有好的感官特征2。目前，常用的益生菌種類(lèi)有雙岐桿菌，乳酸桿菌和一些鏈球菌。其中，雙岐桿菌有青春雙岐桿菌、短雙岐桿菌等；乳酸桿菌有嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、胚芽乳桿菌、短乳桿菌、纖維二糖乳桿菌和乳酸乳桿菌。其他用作益生菌的鏈球菌有：糞鏈球菌、乳鏈球菌、嗜熱唾液鏈球菌和乙酸乳酸雙鏈球菌。此外，還有明串球菌屬、足球菌屬、丙酸桿菌屬和芽孢桿菌屬的菌種也可用作益生菌。通常，應(yīng)用于人體的益生菌有雙岐桿菌、乳酸桿菌、腸球菌、枯草桿菌、臘樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌等，尤以雙岐桿菌、乳酸桿菌、腸球菌應(yīng)用廣泛，其研究也較多。1.2 功效益生菌的功效多種多樣，不同的研究者的結(jié)論雖各有差異，但他們均認(rèn)同益生菌的如下功效：（1）改善腸道功能，根據(jù)陳有容等的研究，與腸道微生物耐性降低有關(guān)的免疫系統(tǒng)功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致慢性腸炎疾病，而這可以通過(guò)益生菌得到改善。另外益生菌在腸內(nèi)繁殖，產(chǎn)生大量乳酸和醋酸，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，改善通便；抑制外襲菌，因而可消除腸道感染和腹瀉3。（2）免疫功能，M.T. Hamilton-Miller等對(duì)一些益生菌進(jìn)行的研究表明：有些益生菌能夠影響人體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答能力，不同菌體的影響程度不同4。而T. Mattila等也通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了乳酸桿菌能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力5。（3）營(yíng)養(yǎng)、抗癌、調(diào)節(jié)血脂、抗高血壓等功能6。2 益生菌耐藥性的分子機(jī)制 與普通細(xì)菌的耐藥性一樣，益生菌耐藥性的分子機(jī)制一般分為：益生菌本身的固有特性，即耐藥性存在于益生菌自身的染色體上，具有典型的種屬特異性；獲得性耐藥，由后天獲得，來(lái)源于基因突變或獲得新基因。2.1 固有耐藥性有些細(xì)菌或益生菌由于具有一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)或代謝，天生對(duì)某些藥物不敏感。如芽孢桿菌，枯草桿菌等為革蘭氏陰性菌，由于其有不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性類(lèi)抗菌藥物天然不敏感，常見(jiàn)革染氏陰性桿菌對(duì)氨芐青霉素耐藥率為100。嗜麥芽寡養(yǎng)單孢菌對(duì)亞胺培南和氨曲南耐藥率為100，究其原因?yàn)槭塞溠抗佯B(yǎng)單孢菌產(chǎn)生L1及L2型B一內(nèi)酰胺酶，兩者均為可誘導(dǎo)酶，前者屬于金屬B一內(nèi)酰胺酶，后者屬于絲氨酸活性酶，L1型酶是導(dǎo)致該菌對(duì)碳青烯類(lèi)藥物亞胺培南天然耐藥的主要原因7。在某些乳桿菌、腸球菌等革蘭氏陰性益生菌中由于細(xì)胞膜的通透性改變致使藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)減少，就使得微生物細(xì)胞表現(xiàn)出抗藥性。雖然大多數(shù)情況下，外膜孔蛋白缺失不是主要的耐藥機(jī)制，但它可降低益生菌對(duì)抗生素的敏感性，在其它的耐藥機(jī)制存在的情況下，可明顯提高耐藥程度。2.2 獲得耐藥性2.2.1 益生菌基因突變與藥物選擇一些益生菌耐藥性的產(chǎn)生不是由于益生菌與藥物接觸而產(chǎn)生，而是自發(fā)突變加上藥物長(zhǎng)期選擇的結(jié)果7。通常認(rèn)為，抗藥益生菌所含的抗菌基因是由敏感菌的遺傳物質(zhì)自發(fā)突變產(chǎn)生的，但一般自發(fā)突變的頻率極低。極少量的抗藥益生菌存在于大量的敏感菌之中原本不足為害，但經(jīng)臨床頻繁使用抗生素之后，藥物殺死或抑制敏感菌的生長(zhǎng)，而抗藥性細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，無(wú)形中對(duì)抗藥益生菌起了選擇作用，造成抗菌株的大量增殖，形成抗藥益生菌系?？股氐膹V泛使用導(dǎo)致耐藥菌株不斷被篩選出來(lái)，并廣泛傳播。傳統(tǒng)上認(rèn)為突變發(fā)生于菌染色體DNA，但突變也可發(fā)生于質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上的DNA。除結(jié)構(gòu)基因突變外某些調(diào)節(jié)基因的突變也可導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。如益生菌耐氟喹諾酮的主要機(jī)制主要是通過(guò)改變DNA解旋酶和或拓樸酶IV來(lái)改變靶位，或降低藥物滲透力和提高外排系統(tǒng)活性，以減少細(xì)胞間藥物蓄積。氟喹諾酮耐藥的進(jìn)化源于染色體內(nèi)基因自發(fā)突變的累積，是一個(gè)逐步發(fā)展的過(guò)程8。靶基因的突變?nèi)绻Q(chēng)不上是普遍的至少是常見(jiàn)的，靶基因突變只引起對(duì)氟喹諾酮類(lèi)的特異性耐藥，而菌外排泵活性或滲透性的改變則不僅能導(dǎo)致對(duì)喹諾酮的耐藥，還對(duì)其他抗菌藥物耐藥，如-內(nèi)酰胺類(lèi)藥、四環(huán)素和氯霉素等9。對(duì)氟喹諾酮較敏感的菌株至少在gyrA的Ser83位置上有一個(gè)突變點(diǎn)，并且對(duì)第一代喹諾酮如萘啶酸耐藥，在這個(gè)研究中的耐藥菌株都同時(shí)有g(shù)yrA和parC變異10。2.2.2 菌體間耐藥基因的相互轉(zhuǎn)移益生菌的菌耐藥基因來(lái)源可以說(shuō)比較復(fù)雜，其不僅可以由染色體攜帶，還常由染色體外的質(zhì)粒11、轉(zhuǎn)座子或整合子12攜帶，通過(guò)融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化在不同種屬的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或集聚重排造成多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升13。外源性相關(guān)的DNA小片段組合為內(nèi)源性基因，它們幾乎都通過(guò)自然轉(zhuǎn)化和重組形成。對(duì)于自然轉(zhuǎn)移的耐藥質(zhì)粒通過(guò)接合傳播似乎是最常見(jiàn)的方式14。益生菌中帶有耐藥性基因的質(zhì)?？勺孕袕?fù)制，代代相傳，并在不同種屬問(wèn)(特別是腸道菌如腸球菌)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而導(dǎo)致抗藥性的廣泛傳播。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)菌和益生菌的耐藥機(jī)制及快速檢測(cè)方法進(jìn)行了卓有成效的研究，并已取得了突破性進(jìn)展15，但由于益生菌耐藥性機(jī)理是個(gè)十分復(fù)雜的問(wèn)題，還存在著許多問(wèn)題，有待我們進(jìn)一步解決。3 益生菌耐藥性研究3.1 乳桿菌耐藥性近年來(lái)，相對(duì)其它益生菌而言，對(duì)乳桿菌的抗生素敏感性進(jìn)行的研究比校深入。有少部分研究者認(rèn)為乳桿菌具有耐藥性是有利的，當(dāng)人們利用抗生素治療疾病的時(shí)候不會(huì)將對(duì)人體有益的乳桿菌也一同殺滅。但是，有些乳桿菌有可能是潛在的致病菌，一旦成為致病原，由于它們具有耐藥性將無(wú)法利用抗生素對(duì)其進(jìn)行治療。而且更重要的是，有些乳桿菌的耐藥性具有可轉(zhuǎn)移性，可能會(huì)轉(zhuǎn)移到其它乳酸菌或致病菌中，對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生威脅16。據(jù)報(bào)道目前至少有25種乳桿菌具有固有的質(zhì)粒，而且有的一種菌株里面有多個(gè)質(zhì)粒17，例如，具有廣譜宿主接合性的耐藥性質(zhì)粒pAMI31和piP501能夠進(jìn)行種間接合。研究者還對(duì)從風(fēng)干的香腸中分離出來(lái)的一些乳桿菌進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們具有一些大小約為10 KB左右的質(zhì)粒(少數(shù)大于25 KB)，在這些質(zhì)粒上攜帶了四環(huán)素耐藥基因tet(M)18。此外，從植物乳桿菌5057株中還分離出來(lái)了攜帶四環(huán)素耐藥基因的質(zhì)粒pMD5057，該質(zhì)粒已經(jīng)完成了測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的四環(huán)素耐藥基因tet(M)與產(chǎn)氣莢膜梭菌和金黃色葡萄球菌中tet(M)的序列高度同源。近來(lái)在紅霉素耐藥的發(fā)酵乳桿菌中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)19.3KB的質(zhì)粒，攜帶一種新的紅霉素耐藥性決定基因erm(LF)。羅伊乳桿菌發(fā)酵乳桿菌，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的中存在R質(zhì)粒，它攜帶紅霉素、氯霉素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)林克霉素鏈陽(yáng)性菌素的耐藥基因19。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、卡拉霉素、慶大霉素、鏈霉素、甲硝銼、氟哌酸、頭孢噻、環(huán)丙沙星、利福平等藥物具有固有耐藥性20。3.2 雙歧桿菌耐藥性不同類(lèi)型的抗生素對(duì)雙歧桿菌的敏感性相差很大，-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)類(lèi)、氯霉素類(lèi)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)和利福平對(duì)該菌株較為敏感，而氨基糖苷類(lèi)和黃胺類(lèi)則不敏感20。這可能是由于雙歧桿菌的細(xì)胞壁含有較多肽聚糖，使得有些抗生素不易通過(guò)。也有人認(rèn)為是由于雙歧桿菌可分泌與糖代謝有關(guān)的酶，這些酶可分解氨基糖苷類(lèi)抗生素，從而使其具有抗藥性，而雙歧桿菌中質(zhì)粒的存在也會(huì)對(duì)其耐藥性產(chǎn)生較大影響21。據(jù)張燕燕等人通過(guò)對(duì)雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和從酸奶中分離的4株雙歧桿菌菌株進(jìn)行環(huán)丙沙星的耐藥性試驗(yàn)，從中篩選出耐藥菌株，再用質(zhì)子泵抑制劑2，4-二硝基酚結(jié)合熒光分光光度法檢測(cè)了耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)環(huán)丙沙星的攝取情況，通過(guò)對(duì)比2，4-二硝基酚存在與否菌體對(duì)環(huán)丙沙星的攝取量變化，從而確證了雙歧桿菌外排系統(tǒng)的存在，其實(shí)驗(yàn)表明雙歧桿菌有外排系統(tǒng)作用介導(dǎo)的對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的機(jī)制22。同樣的，雙歧桿菌對(duì)萬(wàn)古霉素、卡拉霉素、慶大霉素、鏈霉素、甲硝銼、氟哌酸、多粘菌素等藥物具固有耐藥性23?？偟膩?lái)說(shuō)，雙歧桿菌存在廣泛的耐藥性，實(shí)驗(yàn)室目前分離的雙歧桿菌幾乎都存在不同程度的耐藥性。3.3 腸球菌耐藥性腸球菌種類(lèi)多，但由于抗生素大量濫用，如今的腸球菌相比其它益生菌而言，更易具耐藥性。目前許多乳酸菌屬都對(duì)萬(wàn)古霉素具有耐藥性，而我們知道萬(wàn)古霉素是其它抗生素失效后的最后一道防線(xiàn)24，但值得重視的是，某些腸球菌所具有的萬(wàn)古霉素耐藥性還可以轉(zhuǎn)移給其他菌屬。腸球菌屬也是一種較易發(fā)生接合性轉(zhuǎn)移的菌屬，它是一種常用的接合受體菌，但同時(shí)它也可以作為供體菌向非親緣關(guān)系的腸球菌，乳酸桿菌和其他革蘭陽(yáng)性菌例如芽胞桿菌，葡萄球菌和李斯特菌，甚至是革蘭陰性菌轉(zhuǎn)移耐藥基因25。研究發(fā)現(xiàn)參與接合性轉(zhuǎn)移的DNA元件包括攜帶卡那霉素耐藥基因的質(zhì)粒和攜帶四環(huán)素與紅霉素耐藥基因的轉(zhuǎn)座子26。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有許多研究者對(duì)腸球菌的耐藥性進(jìn)行了研究，糜祖煌研究認(rèn)為，腸球菌的B內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥多數(shù)與葡萄球菌一樣，是因?yàn)楫a(chǎn)B內(nèi)酰胺酶所致；而腸球菌對(duì)低濃度和中濃度的氨基糖苷類(lèi)藥物表現(xiàn)為天然耐藥；腸球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林可霉素類(lèi)、鏈陽(yáng)菌素B類(lèi)抗菌藥物有著相同的抗菌機(jī)制和耐藥機(jī)制，即通過(guò)產(chǎn)生紅霉素甲基化酶27。此外，國(guó)內(nèi)許多研究者通過(guò)分子生物學(xué)的方法對(duì)腸球菌的耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，成果顯著。3.4 其它益生菌耐藥性由于前面幾種益生菌較常見(jiàn)，應(yīng)用也較廣泛，因此人們對(duì)它們的研究也較多，而其它的益生菌卻問(wèn)津者寡，僅有零星報(bào)導(dǎo)。據(jù)宋戰(zhàn)昀等人的研究認(rèn)為，枯草桿菌細(xì)胞膜上存在Bmr等主動(dòng)外排系統(tǒng)，編碼Bmr蛋白的基因bmr在染色體上的擴(kuò)增或者在質(zhì)粒內(nèi)的過(guò)度表達(dá)都會(huì)導(dǎo)致枯草桿菌表現(xiàn)多重耐藥，包括溴化乙錠、羅丹明6G、四環(huán)素、丫啶橙、氯霉素、諾氟沙星等氟喹諾酮類(lèi)藥物28。張培德等人用亞硝基胍對(duì)球形芽孢桿菌進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選到利福平和鏈霉素二個(gè)標(biāo)記菌株，抗藥濃度均達(dá)100 uml枷培養(yǎng)基，且其抗藥性狀能夠獲得較好地遺傳29。丙酸桿菌、益生鏈球菌、酵母菌等也有其耐藥性的少量報(bào)導(dǎo)，但本人認(rèn)為其研究才剛剛起步。4 結(jié)語(yǔ) 益生菌與其他細(xì)菌一樣為了在抗生素條件下生存就會(huì)發(fā)生基因突變、轉(zhuǎn)移、重組等耐藥現(xiàn)象，因此我們一方面要避免抗生素的濫用，另一方面也要避免使用具有可轉(zhuǎn)移性耐藥性的益生菌，同時(shí)，我們也要避免具有可轉(zhuǎn)移耐藥性的細(xì)菌從動(dòng)物來(lái)源進(jìn)入食物而引起體內(nèi)的益生菌產(chǎn)生耐藥性。總之，無(wú)論出于何種原因，作為益生菌都不應(yīng)該具有耐藥性。伴隨著蓬勃發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)，今后的研究將會(huì)徹底闡明益生菌的耐藥機(jī)理，從而開(kāi)發(fā)出新型益生菌，為人類(lèi)健康服務(wù)。參考文獻(xiàn)：1 Fuller R. 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