國(guó)家飼料添加劑飼料用復(fù)合酶制劑標(biāo)準(zhǔn)(doc 25頁(yè)).doc

DB33/T 2003DB33浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2004-01-01實(shí)施2003-12-09發(fā)布飼料添加劑飼料用復(fù)合酶制劑Feed additivesComplex enzymatic preparation for feedDB33/T 4592003浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ICS 65.120B 46備案號(hào)：14778-2004XIXDB33/T 4592003目 次前言III引言IV1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語(yǔ)和定義14 產(chǎn)品分類、酶種范圍及安全性25 要求26 試驗(yàn)方法37 檢驗(yàn)規(guī)則48 標(biāo)志、標(biāo)簽59 包裝、運(yùn)輸、貯存5A.1 原理6A.2 試劑和溶液6A.3 儀器和設(shè)備7A.4 測(cè)定步驟7A.5 酶活力計(jì)算8A.6 精密度8附錄B9B.1 原理9B.2 試劑和溶液9B.3 儀器和設(shè)備9B.4 測(cè)定步驟10B.5 酶活力計(jì)算11B.6 精密度11附錄C12C.1 原理12C.2 試劑和溶液12C.3 儀器和設(shè)備12C.4 測(cè)定步驟13C.5 酶活力計(jì)算14C.6 精密度14附錄D15D.1 原理15D.2 試劑和溶液15D.3 儀器和設(shè)備15D.4 測(cè)定步驟16D.5 酶活力計(jì)算17D.6 精密度17附錄E18E.1 國(guó)際酶活力單位18E.2 輕工部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位18E.3 國(guó)內(nèi)其它資料酶活力單位19III前 言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C、附錄D為規(guī)范性附錄，附錄E為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省飼料與動(dòng)物保健品協(xié)會(huì)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)負(fù)責(zé)起草單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)參加起草單位：浙江省飼料監(jiān)察所、浙江王景寶飼料股份有限公司、長(zhǎng)興藍(lán)鑫生物技術(shù)有限公司、長(zhǎng)興大洋生物飼料有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：許堯興、樓洪興、方阿慶、蘇衛(wèi)琴、王有良、宣士榮、汪剛。引 言本標(biāo)準(zhǔn)是針對(duì)以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)、含有二種或二種以上主要功效酶成分、經(jīng)配置而成的飼料用復(fù)合酶制劑。考慮到市場(chǎng)上的飼料用復(fù)合酶制劑品種繁多，等級(jí)不一，酶活標(biāo)示方法各不相同，故制定本標(biāo)準(zhǔn)，以統(tǒng)一我省飼料用復(fù)合酶制劑中主要酶系的酶活力單位定義，相關(guān)酶系的酶活力測(cè)定方法的及產(chǎn)品中各種酶的最低酶活指標(biāo)，便于科研、生產(chǎn)、銷售和使用單位的相互交流和使用。產(chǎn)品分類中，飼料用復(fù)合酶制劑根據(jù)畜禽種類和日糧類型不同而分為通用、豬用、禽用及水產(chǎn)動(dòng)物用幾種類型。而每種類型又可根據(jù)具體的日糧或畜禽生長(zhǎng)階段細(xì)分成若干種類型。適用本標(biāo)準(zhǔn)中飼料用復(fù)合酶制劑的主要酶種有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纖維素酶。本標(biāo)準(zhǔn)特別強(qiáng)調(diào)了飼料用復(fù)合酶制劑的安全性，指出：由發(fā)酵法，特別是固體發(fā)酵法生產(chǎn)獲得的飼料用復(fù)合酶的酶源，需說(shuō)明相應(yīng)酶種的產(chǎn)生菌種及安全性。采用的產(chǎn)酶菌種應(yīng)是我國(guó)農(nóng)業(yè)部105號(hào)公告公布的允許使用的12種飼料級(jí)微生物菌種，或應(yīng)符合食品添加劑使用的菌株為酶源的發(fā)酵菌株。附錄A所述的“蛋白酶活力測(cè)定方法”是參照輕工部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 1805工業(yè)用蛋白酶制劑的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。附錄B、附錄C、附錄D是通過(guò)測(cè)定幾種非淀粉多糖酶（木聚糖酶、葡聚糖酶、纖維素酶）分解相應(yīng)底物生成的還原糖來(lái)反映幾種酶的總酶活力。附錄E是資料性附錄，將本標(biāo)準(zhǔn)中幾種非淀粉多糖酶的酶活力與國(guó)際酶活力及國(guó)內(nèi)其它單位表示方法所獲得的酶活力之間的換算。生產(chǎn)者和使用者可根據(jù)不同產(chǎn)品酶活力表示方法，進(jìn)行相互換算，以資比較。由于飼料用酶制劑基本上采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，酶系組成、相關(guān)濃度和化學(xué)結(jié)構(gòu)的不確定性，以及作用底物（飼料原料）的多樣性，各種終產(chǎn)物的不斷形成及反饋控制等因素的影響，因此，各實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的底物、pH、反應(yīng)時(shí)間與溫度等條件操作是十分重要的。本標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生指標(biāo)部分參照了FAO/WHO下屬的JECF食品添加劑綱要第一卷中食品工業(yè)用酶制劑通則中的“衛(wèi)生指標(biāo)”,以及國(guó)家輕工部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)用酶制劑通用試驗(yàn)方法中有關(guān)食品級(jí)酶制劑的衛(wèi)生指標(biāo)；本標(biāo)準(zhǔn)酶活力的測(cè)定，參考了國(guó)家有關(guān)行業(yè)推薦的方法及國(guó)內(nèi)外、省內(nèi)外相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定方法和國(guó)內(nèi)外相關(guān)資料，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，修改而成。飼料添加劑飼料用復(fù)合酶制劑1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料添加劑飼料用復(fù)合酶制劑的術(shù)語(yǔ)和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則和標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯存條件。本標(biāo)準(zhǔn)適用于在浙江省境內(nèi)生產(chǎn)、銷售、使用的飼料用復(fù)合酶制劑產(chǎn)品。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 191-2000 包裝、儲(chǔ)運(yùn)、圖示標(biāo)志GB/T 5917-1986配合飼料粉碎粒度測(cè)定方法GB/T 6435-1986飼料水分的測(cè)定方法GB 10648 飼料標(biāo)簽GB/T 130791999飼料中總砷的測(cè)定GB/T 130801991 飼料中鉛的測(cè)定方法GB/T 130821991 飼料中鎘的測(cè)定方法GB/T 13091-2000 飼料中沙門氏菌的檢測(cè)方法GB/T 174801998飼料中黃曲霉毒素B1的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法GB/T 18869-2002 飼料中大腸菌群的測(cè)定QB/T 1803工業(yè)用酶制劑通用試驗(yàn)方法國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局(1995)第43號(hào)令定量包裝商品計(jì)量監(jiān)督規(guī)定3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)、定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1飼料用酶制劑 Enzymatic Preparation for Feed飼料用酶制劑是通過(guò)產(chǎn)酶微生物發(fā)酵工程或含酶動(dòng)、植物組織提取技術(shù)生產(chǎn)加工而成，具有一種或幾種底物清楚的酶催化活性，有助于改善動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收等，并有生物學(xué)評(píng)定依據(jù)，符合安全性要求，作飼料添加劑用的酶制劑產(chǎn)品。3.2飼料用復(fù)合酶制劑 Complex Enzymatic Preparation for Feed產(chǎn)品中含有二種或二種以上主要功效酶成分，這些酶是依據(jù)飼料原料和動(dòng)物消化生理不同而特定復(fù)配，對(duì)飼料中多種成分具有酶催化作用的飼料用酶制劑。3.3原料酶 Material Enzyme以微生物為產(chǎn)酶菌種，采用固體發(fā)酵工程途徑生產(chǎn)，經(jīng)低溫干燥所獲得的、未添加任何其它載體的固體酶曲，定義為原料酶。3.4酶活單位 Enzymatic Unite根據(jù)作用底物的不同，對(duì)飼料用復(fù)合酶中相關(guān)酶種的酶活單位作如下定義。3.4.1蛋白酶 Protanase在（400.2）、相應(yīng)的pH條件下(酸性蛋白酶pH3.5,中性蛋白酶pH7.0)，在1min內(nèi)水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克酚類化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。3.4.2木聚糖酶 Xylanse在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min內(nèi)水解木聚糖底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克木糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。3.4.3-葡聚糖酶 -glucanase在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min內(nèi)水解-葡聚糖底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g (u/ml)表示。3.4.4纖維素CMC酶 Cellulase在（400.2）、pH 4.2條件下，在1min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。4 飼料用復(fù)合酶制劑的分類、酶種范圍及安全性4.1 飼料用復(fù)合酶制劑的分類飼料用復(fù)合酶制劑根據(jù)畜禽種類和日糧類型不同而分為通用、豬用、禽用及水產(chǎn)動(dòng)物用幾種類型。而每種類型又可根據(jù)具體的日糧或畜禽生長(zhǎng)階段細(xì)分成若干種類型(詳見(jiàn)表1)。4.2 飼料用復(fù)合酶制劑的酶種范圍適用本標(biāo)準(zhǔn)中飼料用復(fù)合酶制劑的主要酶種有：酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、-葡聚糖酶和纖維素酶。其它酶種可根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整。4.3 飼料用復(fù)合酶制劑的安全性由發(fā)酵法，特別是固體發(fā)酵法生產(chǎn)獲得的飼料用復(fù)合酶的酶源，需說(shuō)明相應(yīng)酶種的產(chǎn)生菌種及安全性。采用的產(chǎn)酶菌種應(yīng)是我國(guó)農(nóng)業(yè)部105號(hào)公告公布的允許使用的12種飼料級(jí)微生物菌種，或應(yīng)符合食品添加劑使用的菌株為酶源的發(fā)酵菌株。5 要求5.1 感官指標(biāo)色澤均勻，無(wú)發(fā)霉變質(zhì)、結(jié)塊及異味異嗅。5.2 酶活力指標(biāo)飼料用復(fù)合酶產(chǎn)品中的酶系及酶活力指標(biāo)應(yīng)符合表1規(guī)定。表中所示酶活力指標(biāo)為產(chǎn)品中最低酶活力指標(biāo)（以該酶制劑產(chǎn)品在飼料中添加量0.1%計(jì)，若添加量大于或小于0.1%,其產(chǎn)品中的相應(yīng)酶活可適當(dāng)降低或增加）。表1飼料用復(fù)合酶制劑的酶活力指標(biāo)產(chǎn) 品 型 號(hào)產(chǎn) 品 成 份 標(biāo) 簽 值(u/g)通用小麥型復(fù)合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶25000-葡聚糖酶5000纖維素酶2500 通用玉米型復(fù)合酶酸性蛋白酶2000 木聚糖酶10000-葡聚糖酶5000纖維素酶1500通用稻谷型復(fù)合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶15000纖維素酶3500 - 乳仔豬用復(fù)合酶酸性蛋白酶2500木聚糖酶10000中性蛋白酶1000纖維素酶1000豬用玉米型復(fù)合酶酸性蛋白酶2000木聚糖酶10000-葡聚糖酶10000 纖維素酶2000 豬用小麥型復(fù)合酶酸性蛋白酶1500木聚糖酶25000-葡聚糖酶10000纖維素酶2500 豬用大麥型復(fù)合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶10000-葡聚糖酶20000纖維素酶2000 禽用玉米型復(fù)合酶酸性蛋白酶2000木聚糖酶15000-葡聚糖酶10000纖維素酶1200 禽用小麥型復(fù)合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶20000-葡聚糖酶10000纖維素酶2000 肉雞用復(fù)合酶酸性蛋白酶1500木聚糖酶15000-葡聚糖酶10000纖維素酶1500 蛋雞用復(fù)合酶酸性蛋白酶1000木聚糖酶20000-葡聚糖酶10000纖維素酶1500 水產(chǎn)動(dòng)物(甲魚(yú))用復(fù)合酶酸性蛋白酶1500中性蛋白酶3000-注：以上各產(chǎn)品中的酶系及酶活力指標(biāo)，可按應(yīng)用原料的不同作適當(dāng)調(diào)整。5.3 衛(wèi)生指標(biāo)衛(wèi)生指標(biāo)應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2飼料用復(fù)合酶制劑的衛(wèi)生指標(biāo)砷，mg/kg,（以As 計(jì)）5.0鉛，mg/kg,（以 Pb計(jì)）10.0鎘，mg/kg,（以 Cd計(jì)）0.5沙門氏菌，不得檢出大腸菌群，MPN/100g3000黃曲霉毒素B1, mg/kg0.05注： 不得檢出國(guó)家明令禁止的藥物和物質(zhì)。5.4 粒度孔徑0.325mm（60目篩）分析篩篩上物，不大于20%。5.5 水分不大于10%。5.6 凈含量按國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局（1995）第43號(hào)令執(zhí)行。6 試驗(yàn)方法6.1 感官要求取樣品適量，進(jìn)行感官檢驗(yàn)，觀察、嗅聞或觸摸。6.2 酶活力6.2.1 蛋白酶活力（酸性、中性）按附錄A測(cè)定。6.2.2 木聚糖酶活力按附錄B測(cè)定。6.2.3 -葡聚糖酶活力按附錄C測(cè)定。6.2.4 纖維素CMC酶活力按附錄D測(cè)定。6.3 砷（As）按GB/T13079-1999執(zhí)行。 6.4 鉛（Pb）按GB/T 13080-1991執(zhí)行。6.5 鎘（Cd）按GB/T13082-1991執(zhí)行。6.6 沙門氏菌按GB/T 13091-2000執(zhí)行。6.7 大腸菌群按GB/T 18869-2002執(zhí)行。6.8 黃曲霉毒素B1按GB/T 17480-1998執(zhí)行。6.9 水分按GB/T 6435-1986執(zhí)行。6.10 粒度按GB/T 5917-1986執(zhí)行。6.11 凈含量用適宜感量的衡器進(jìn)行檢驗(yàn)。7 檢驗(yàn)規(guī)則7.1 組批的定義生產(chǎn)廠以每一班次生產(chǎn)且經(jīng)包裝的、具有同樣工藝條件、同一產(chǎn)品名稱、批號(hào)、規(guī)格和同樣質(zhì)量證明書(shū)的產(chǎn)品為一個(gè)組批。7.2 取樣方法從每批產(chǎn)品的包裝中隨機(jī)抽取。用清潔適用的取樣工具伸入所取樣品的四分之三深處，用交叉法取出足夠量的樣品，將采得的樣品充分混合均勻按四分法縮分至250g，平分裝入兩個(gè)清潔、干燥具有密閉性和避光性的具塞樣品瓶中，貼上標(biāo)簽，注明生產(chǎn)廠名稱、產(chǎn)品名稱、批號(hào)、取樣日期等。7.3 檢驗(yàn)分類產(chǎn)品分為出廠檢驗(yàn)和型式檢驗(yàn)。7.3.1 出廠檢驗(yàn)7.3.1.1 出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目感官指標(biāo)、酶活力、水分、粒度、凈重。7.3.1.2 判定方法對(duì)抽取的樣品按出廠檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)結(jié)果中有任何一項(xiàng)指標(biāo)不合格時(shí)，應(yīng)重新取樣進(jìn)行復(fù)檢，取樣范圍或樣品數(shù)量為第一次取樣量的兩倍，復(fù)檢結(jié)果中仍有指標(biāo)不合格，則整批產(chǎn)品判為不合格，不能出庫(kù)。7.3.1.3 判定結(jié)論每批產(chǎn)品應(yīng)由生產(chǎn)廠質(zhì)量檢驗(yàn)部門進(jìn)行出廠檢驗(yàn)，只有檢驗(yàn)合格后方可簽發(fā)合格證出廠。7.3.2 型式檢驗(yàn)7.3.2.1 型式檢驗(yàn)項(xiàng)目型式檢驗(yàn)的樣品必須從出廠檢驗(yàn)合格產(chǎn)品中隨機(jī)抽取。型式檢驗(yàn)項(xiàng)目為本標(biāo)準(zhǔn)“5要求”中各項(xiàng)指標(biāo)。7.3.2.2 型式檢驗(yàn)的范圍有下列情況之一時(shí)，應(yīng)進(jìn)行型式檢驗(yàn)：a).審發(fā)生產(chǎn)許可證、產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)時(shí)；b).產(chǎn)品的原輔材料、工藝過(guò)程及主要設(shè)備有較大變化時(shí)；c).停產(chǎn)6個(gè)月以上，恢復(fù)生產(chǎn)時(shí)；d).出廠檢驗(yàn)結(jié)果與上次型式檢驗(yàn)有較大差異時(shí)；e).當(dāng)用戶對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有較大異議時(shí)。7.3.2.3 判定方法對(duì)抽取的樣品按型式檢驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行檢驗(yàn)，如果檢驗(yàn)結(jié)果中有任何一項(xiàng)指標(biāo)不合格時(shí)，應(yīng)重新取樣進(jìn)行復(fù)檢，但衛(wèi)生指標(biāo)如有一項(xiàng)不合格時(shí)，即判為不合格產(chǎn)品，不得復(fù)檢。復(fù)檢的取樣范圍或樣品數(shù)量是第一次取樣的兩倍。復(fù)檢結(jié)果仍有指標(biāo)不合格，則判為不合格產(chǎn)品。8 標(biāo)志、標(biāo)簽8.1 標(biāo)志產(chǎn)品的外包裝應(yīng)有產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)廠家、規(guī)格、注冊(cè)商標(biāo)、生產(chǎn)許可證號(hào)、產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)、凈重、防潮防曬標(biāo)志，同時(shí)還應(yīng)注明“飼料添加劑”字樣，并采用鮮明的飼料標(biāo)簽，符合GB/T 191-2000規(guī)定。8.2 標(biāo)簽按GB 10648執(zhí)行。9 包裝、運(yùn)輸、貯存9.1 包裝產(chǎn)品的包裝需具備：密封、防水、避光、一定的強(qiáng)度要求和一定的包裝規(guī)格等。9.2 運(yùn)輸產(chǎn)品含有生物活性物質(zhì)，光線、溫度、濕度易引起失活。運(yùn)輸工具必須清潔、干燥，有防雨防曬設(shè)施，搬運(yùn)裝卸小心較放。不得與有毒有害及其它污染物品混裝混運(yùn)。9.3 貯存產(chǎn)品需于陰涼、干燥、避光處貯存。貯存?zhèn)}庫(kù)需保持清潔、陰涼、干燥、通風(fēng)，防受熱、受潮。不得與有毒有害及其它污染物品混貯。9.4 保質(zhì)期產(chǎn)品原包裝需注明保質(zhì)期。在本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定條件下，保質(zhì)期為6個(gè)月。附錄A（規(guī)范性附錄）蛋白酶活力的測(cè)定方法A.1 原理蛋白酶在一定的溫度和pH條件下，水解酪素底物產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過(guò)在660nm測(cè)定其吸光度，可得到酶解產(chǎn)生的酚基氨基酸的量，計(jì)算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的總酶活力。A.2 酶活單位定義在（400.2）、相應(yīng)的pH條件下(酸性蛋白酶pH3.5,中性蛋白酶pH7.0)，在1min內(nèi)水解酪蛋白底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克酚類化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。A.3 試劑和溶液 除非另有規(guī)定外，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。A.3.1 1 mol/L及0.1 mol/L鹽酸 (HCl)溶液取濃鹽酸85ml，加水稀釋并定容至1000 ml，即為1mol/L鹽酸溶液；取100ml 1mol/L鹽酸溶液，定容至1000 ml，即為0.1 mol/L鹽酸溶液。A.3.2 1mg/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液精確稱取預(yù)先于105 oC干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20ml 左右1mol/L鹽酸l溶解后，再用蒸餾水定容至100ml，即為1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。A.3.3 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液吸取1mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.0 ml用0.1 mol/L鹽酸定容至100 ml,即得到100 g/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取100g/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液 0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0 ml于10ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成每ml分別含L-酪氨酸0g、10g、20g、30g、40g、50g、60 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。A.3.4 0.4 mol/L 碳酸鈉（Na2CO3）溶液稱取無(wú)水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。A.3.5 福林（Folin）試劑于2000ml磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2WO4.2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4.2H2O)25g、蒸餾水700ml、85%磷酸50ml、濃鹽酸100ml。小火沸騰回流10h，取下回流冷卻器，在通風(fēng)廚中加入硫酸鋰（ Li2SO4）50g，加蒸餾水50ml和數(shù)滴濃（99%）溴水，再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過(guò)量的溴），冷卻后加蒸餾水定容至1000ml。混勻、過(guò)濾。試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶?jī)?nèi)。使用時(shí)，以1份原Folin試劑與2份蒸餾水混勻，制成稀Folin試劑。A.3.6 乳酸緩沖液(pH=3.5),適用于酸性蛋白酶甲液：稱取80%90%乳酸10.6 g，加水稀釋并定容至1000ml。乙液：稱取70%乳酸鈉16 g，加水稀釋并定容至1000ml。使用液：取甲液2份，加乙液1份，再準(zhǔn)確稀釋1倍。用pH計(jì)校正pH至3.5。A.3.7 磷酸緩沖液（pH=7.0）,適用于中性蛋白酶 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O ）71.64 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取磷酸二氫鈉（NaH2PO4.2H2O ）31.21 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液610ml，加乙液390ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（7.0 0.05）,備用。A.3.8 1.0%酪素溶液稱取酪素1.0000g，先用少量（3ml-4ml）濃乳酸濕潤(rùn)后，（若中性蛋白酶為少量0.5 mol/L氫氧化鈉溶液），再加入相應(yīng)pH緩沖液約80ml,在沸水浴中邊加熱邊攪拌直至完全溶解。冷卻后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，用相應(yīng)緩沖液定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。A.3.9 0.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀試劑)稱取三氯乙酸65.4g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。A.4 儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：A.4.1 恒溫水浴鍋(400.2) oC。A.4.2 分光光度計(jì)A.4.3 酸度計(jì)精度0.01pH 。A.4.4 分析天平感量0.1mg。A.4.5 秒表或定時(shí)鐘。A.5 測(cè)定步驟A.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按表A.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液、0.4mol/L碳酸鈉溶液和稀Folin試劑于各管中（每管號(hào)平行作3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于40oC水浴，反應(yīng)20min，取出，迅速冷卻至室溫，用10mm比色杯，以空白管（0號(hào)管）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)660nm處測(cè)吸光度。以酪氨酸量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸量（g）即為比色常數(shù)K值。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的Folin試劑制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表A.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸使用溶液0.4mol/L碳酸鈉溶液(ml)稀Folin試劑(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）001.05.01.01101.05.01.02201.05.01.03301.05.01.04401.05.01.05501.05.0 1.06601.05.0 1.0A.5.2 樣品的測(cè)定A.5.2.1 待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測(cè)。A.5.2.2 測(cè)定程序取三支15150mm試管（一支空白管，二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液1.0ml 。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%酪素溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入1.0ml 1%酪素溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向三支試管中加入2ml TCL（沉淀試劑），于空白管中加入1.0ml1%酪氨酸溶液，搖勻。將三支試管繼續(xù)置（400.2）oC水浴中放置10min，取出，迅速冷卻至室溫。三支試管中反應(yīng)液用濾紙（Whatman1號(hào)濾紙或新華1號(hào)濾紙）過(guò)濾。另取三支18180mm的試管（一支空白，二支樣品管）分別吸取上述相應(yīng)的濾出液1.0ml，0.4mol/L碳酸鈉溶液5.0ml，稀Foiln試劑1.0ml，搖勻，置（400.2）oC水浴中放置20min，取出，迅速冷卻至室溫。以空白管（對(duì)照）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)660nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出生成的酪氨酸的含量。A.6 酶活力計(jì)算按照下式(A.1)計(jì)算樣品蛋白酶活力： AKV4N X1 (A.1) 1W10 式中：X1蛋白酶活力，u/g；A樣品與空白的的吸光度差K比色常數(shù)；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；4酶反應(yīng)體系總體積（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；1參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g/ml）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。 A.7 精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄B（規(guī)范性附錄）木聚糖酶活力的測(cè)定方法B.1 原理木聚糖酶在一定的溫度和pH條件下，催化木聚糖水解生成二糖、木糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以木糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出木聚糖酶的酶活力。以此代表木聚糖酶的總酶活力。B.2 酶活單位定義在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min內(nèi)水解木聚糖底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克木糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。B.3 試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。B.3.1 1%（W/V）木聚糖底物 精確稱取燕麥木聚糖(xylan from Oat spelts, 美國(guó)Sigma公司)1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。B.3.2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（5.0 0.05）,備用。B.3.3 3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。B.3.4 1%(W/V)木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的木糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。B.3.5 木糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%木糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含木糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。B.4 儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：B.4.1 恒溫水浴鍋(400.2) oC。B.4.2 分光光度計(jì)B.4.3 酸度計(jì)精度0.01pH 。B.4.4 分析天平感量0.1mg。B.4.5 秒表或定時(shí)鐘。B.5 測(cè)定步驟B.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按表B.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)木糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（0號(hào)管）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以木糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表B.1木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)木糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0B.5.2 樣品的測(cè)定B.5.2.1 待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測(cè)。B.5.2.2 操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%木聚糖溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。B.6 酶活力計(jì)算按照下式（B.1）計(jì)算樣品的木聚糖酶的活力：AVN X1 (B.1) 0.5W10 式中：X1木聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。B.7 精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄C（規(guī)范性附錄）-葡聚糖酶活力的測(cè)定方法C.1 原理葡聚糖酶在一定的溫度和pH條件下，催化葡聚糖水解生成分子量較小的低聚糖、葡萄糖等還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表葡聚糖酶的酶活力。C.2 酶活單位定義在（400.2）、pH 5.0條件下，在1min內(nèi)水解-葡聚糖底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g (u/ml)表示。C.3 試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。C.3.1 1%（W/V）葡聚糖底物精確稱取葡聚糖(-glucan,from barley,Sigma 公司產(chǎn))1.0000 g，溶于80ml蒸餾水中，水浴加熱至溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。C.3.2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（5.0 0.05）,備用。C.3.3 3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。C.3.4 1%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。C.3.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。C.4 儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：C.4.1 恒溫水浴鍋(400.2) oC。C.4.2 分光光度計(jì)C.4.3 酸度計(jì)精度0.01pH 。C.4.4 分析天平感量0.1mg。C.4.5 秒表或定時(shí)鐘。C.5 測(cè)定步驟C.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按表C.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表C.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0C.5.2 樣品的測(cè)定C.5.2.1 待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直接用蒸餾水稀釋至適宜濃度，待測(cè)。C.5.2.2 操作程序取三支18180mm試管（一支空白管。二支樣品管）。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入稀釋好的待測(cè)酶液0.50ml 。分別向三支試管中準(zhǔn)確加入pH 5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（B.2.2）1.0ml。將三支試管放入（400.2）oC水浴中預(yù)熱5min，同時(shí)將測(cè)定底物（1%葡聚糖溶液）置同一溫度水浴中預(yù)熱5min。分別向二支樣品管中加入0.5ml1%葡聚糖溶液，向空白管中加入3ml DNS試劑，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)10min，取出。迅速、準(zhǔn)確向二支樣品管中加入3ml DNS試劑，于空白管中加入0.5ml1%木聚糖溶液，搖勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，待水浴中水重新沸騰時(shí)開(kāi)始準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫。向三支試管中各加入10ml蒸餾水，混勻。以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm下，用10mm比色杯，分別測(cè)二支樣品管中樣液的吸光度，取平均值。通過(guò)查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用線性回歸方程求出還原糖的含量。C.6 酶活力計(jì)算按照下式（C.1）計(jì)算樣品的葡聚糖酶的活力：AVN X1 (C.1) 0.5W10 式中：X1葡聚糖酶活力，u/g；A根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得（或從回歸方程計(jì)算出）的還原糖生成量，g；V樣品提取時(shí)加入水的量（ml）；N樣品二次稀釋時(shí)的稀釋倍數(shù)；0.5參與反應(yīng)的酶量（ml）；W樣品重量（g）；10反應(yīng)時(shí)間（min）。C.7 精密度同一試樣兩次測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值，不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。附錄D（規(guī)范性附錄）纖維素（CMC）酶活力的測(cè)定方法D.1 原理纖維素酶在一定的溫度和pH條件下，將纖維素底物（CMC，羧甲基纖維素鈉）水解，釋放出還原糖。在堿性、煮沸條件下，能將3,5-二硝基水楊酸中硝基還原成橙黃色的氨基化合物，其顏色的深淺與還原糖（以葡萄糖計(jì)）含量成正比。通過(guò)其在550nm測(cè)其吸光度，可得到還原糖生成量，計(jì)算出葡聚糖酶的酶活力。以此代表纖維素（CMC）酶的總酶活力。D.2 酶活單位定義在（400.2）、pH 4.2條件下，在1min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉底物，產(chǎn)生相當(dāng)于1微克葡萄糖的還原糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以u(píng)/g(u/ml)表示。D.3 試劑和溶液除非另有規(guī)定，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用水為蒸餾水或去離子水。D.3.1 羧甲基纖維素鈉（CMCNa）中國(guó)醫(yī)藥公司上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)，分析純，在25,2%水溶液粘度300800厘泊爾。D.3.2 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液: 甲液：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4.2H2O ）35.61 g, 用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。 乙液：稱取檸檬酸（C6H8O7.H2O）21.01 g，用蒸餾水溶解，并定容至1000ml。. 使用溶液：取甲液414ml，加乙液586ml混合均勻，用pH計(jì)校正至pH為（4.2 0.05）,備用。D.3.3 1%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）溶液稱取1g羧甲基纖維素鈉，精確至1mg，緩緩加入pH為4.2 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液80ml，水浴加熱至全部溶解。冷卻后用2MHCL或NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到（4.2 0.05），攪拌均勻，定容至100ml，再用二層紗布過(guò)濾。此溶液在4oC冰箱貯存，有效期為3天。D.3.4 3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑: 取酒石酸鉀鈉182g，溶于500ml蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3g， 氫氧化鈉 10g，苯酚5g，無(wú)水亞硫酸鈉5g，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，過(guò)濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置1周后使用。 :注：在黑色或棕色瓶中于室溫下貯存，該試劑最多穩(wěn)定6個(gè)月。D.3.5 1%(W/V)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液稱取預(yù)先于（1032）下干燥至恒重的葡萄糖1.0000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 ml，即為1%濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。D.2.5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液分別吸取1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml置50ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，制成每ml分別含葡萄糖200g、400g、600g、800g、1000g 、1200 g的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。D.4 儀器和設(shè)備 除普通實(shí)驗(yàn)室儀器外，還應(yīng)有：D.4.1 恒溫水浴鍋(400.2) oC。D.3.2 分光光度計(jì)D.4.2 酸度計(jì)精度0.01pH 。D.4.3 分析天平感量0.1mg。D.4.4 秒表或定時(shí)鐘。D.5 測(cè)定步驟D.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按表D.1，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液、緩沖液和DNS試劑于各管中（每管號(hào)平平行3個(gè)樣），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)7min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10ml，混勻。用10mm比色杯，以空白管（對(duì)照液）調(diào)儀器零點(diǎn)，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550nm處測(cè)吸光度。以葡萄糖量為橫座標(biāo)，以吸光度為縱座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。線性回歸系數(shù)（r）應(yīng)在0.9990以上時(shí)方可使用（否則須重做）。對(duì)每個(gè)新配制的DNS溶液制作新的標(biāo)準(zhǔn)曲線。表D.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(ml)DNS試劑吸取量(ml)濃度（g/ml）吸取量（ml）000.501.53.012000.501.53.024000.501.53.036000.501.53.048000.501.53.0510000.501.5 3.0612000.501.53.0D.5.2 樣品的測(cè)定D.5.2.1 待測(cè)酶液的制備固體酶：根據(jù)樣品酶活大小，稱取2g10g固體酶樣，精確至0.1mg，加入40200ml蒸餾水，溶解后置40oC水浴浸提30min，用濾紙過(guò)濾，再根據(jù)樣品酶活性大小，二次稀釋至適宜濃度（使供試樣液與空白液的吸光度之差落在0.2-0.4之間，下同）。液體酶：精確量取液體酶若干ml，根據(jù)樣品酶活力大小，直