黃金金 不同生長環(huán)境下豆腐柴POD同工酶的比較分析.doc

不同生長環(huán)境下豆腐柴POD同工酶的比較分析學(xué)號: 200724140102本 科 生 畢 業(yè) 論 文（設(shè)計）題目：不同生長環(huán)境下豆腐柴POD同工酶的比較分析作 者 姓 名：黃金金 專 業(yè) 班 級：生物科學(xué)2007級01班指 導(dǎo) 教 師：李琳玲 講師 黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院二0一一年四月 第 18 頁 共 17頁鄭 重 聲 明本人的畢業(yè)論文（設(shè)計）是在指導(dǎo)老師李琳玲的指導(dǎo)下獨立撰寫并完成的。畢業(yè)論文（設(shè)計）沒有剽竊、抄襲、造假等違反學(xué)術(shù)道德、學(xué)術(shù)規(guī)范和侵權(quán)行為，本人愿意承擔(dān)由此產(chǎn)生的各種后果；直至法律責(zé)任，并可以通過網(wǎng)絡(luò)接受公眾的查詢。特此聲明。 畢業(yè)論文作者（簽名）：黃金金 2011年4月8日目 錄中文摘要 .1英文摘要（Abstract） .11選題背景 .21.1 豆腐柴概述.21.1.1 豆腐柴的特點.21.1.2 豆腐柴的研究現(xiàn)狀.21.2.1 POD同工酶概述.31.2.2 POD研究現(xiàn)狀.42 方案論證.42.1 實驗方案探討.42.2 實驗原理.53 過程論述.53.1 實驗過程.53.1.1 實驗材料的選取.63.1.2 實驗儀器.63.1.3 實驗試劑.63.1.4 實驗步驟.63.1.4.凝膠貯液及電極緩沖液的配制.63.1.4.2蛋白質(zhì)提取液的配制.73.1.4.3 提取粗蛋白備用.73.1.4.4 凝膠制備及電泳.74結(jié)果與分析.85參考文獻.15致謝.17 不同生長環(huán)境下豆腐柴POD同工酶的比較分析黃金金（生命科學(xué)與工程學(xué)院 生物科學(xué)專業(yè) 200701班）摘 要：小4號，“摘要：”與“關(guān)鍵詞：”加粗，前面空2格；摘要段落：段前空0.5行小4號宋體居中采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳法對馬鞭草科植物豆腐柴在四種不同生長環(huán)境下的莖、葉兩種組織的過氧化物酶(POD)同工酶酶譜進行了研究和分析 。結(jié)果表明：不同生長條件下豆腐柴的POD同工酶酶譜有明顯差異，同一環(huán)境下豆腐柴POD酶譜具有明顯的組織特異性。同工酶的活性變化與環(huán)境和其組織功能相適應(yīng)，其特征性酶帶可作為分類和進化的依據(jù)。 關(guān)鍵詞：豆腐柴；不同組織；POD同工酶；比較分析Abstract: Used the polyacrylamide gelatin vertical board electrophoresis to the Verbenaceae plant bean curd firewood under four kind of different habitats stem, leaf two kind of organizations peroxide enzyme (POD) the isozyme zymogram to conduct the research and the analysis. The result indicated: Under the different yield condition the bean curd firewoods POD isozyme zymogram has the obvious difference, under the identical environment the bean curd firewood POD zymogram has the obvious organization specificity. The isozyme active change and the environment and its organization function adapts, its characteristic value enzyme belt may take classified and the evolution basis.Keywords: Premna; different organizations; POD isozyme; comparative analysis同工酶技術(shù) ，作為在分子水平上研究生命現(xiàn)象的重要手段之一 ，在遺傳學(xué)、分類學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科中得到了日益廣泛的應(yīng)用。由于同工酶在其分布上具有組織特異性和種屬特異性 ，因而作為基因表達的產(chǎn)物和標(biāo)志。遺傳穩(wěn)定的生物個體在一定條件下同一組織的同工酶譜是相對穩(wěn)定的 ，而不同種屬或不同組織的同工酶譜 ，則可有明顯的種屬特異性和組織特異性 ，所以同工酶譜的特異性可作為闡明生物種屬間親緣演化關(guān)系的輔助手段之一。通過同工酶分析 ，可以了解生物個體對環(huán)境變化的適應(yīng)及不同種群遺傳變異的情況。POD 同工酶是植物體內(nèi)的天然標(biāo)記，它可從分子和生化水平反映機體的各種變化, 為植物的品種鑒定、純度分析、抗旱、抗病等方面的研究提供重要的參考價值。 1選題背景 1.1豆腐柴概述1.1.1豆腐柴的特點所屬科：Verbenaceae nom. conserv. 中文名：黃毛豆腐柴灌木或小喬木，高達35米，有時枝條外傾或攀援狀，幼枝密被黃色平展長柔毛，具條紋，后逐漸變無毛，樹皮轉(zhuǎn)紅褐色。葉紙質(zhì)，形狀大小不一，卵圓形、長圓狀卵圓形或者長圓狀倒卵圓形、卵狀披針形、橢圓形或近圓形，長414.5厘米，寬（2.8-）39厘米，先端漸尖、銳尖、極稀近圓形或甚至微凹或倒心形，基部闊楔形、近圓形，偶爾近心形，常偏斜，有時全緣，通常具不整齊的圓鋸齒，稀皺波狀，有時齒尖突出，微硬，表面被較疏的稍硬黃毛，中肋及側(cè)脈上更密而平展，背面密被柔毛；側(cè)脈57對，斜升，微彎曲，表面明顯，背面突出，橫生細脈和網(wǎng)脈僅背面明顯；葉柄長25.5厘米，每對長短不等，與小枝被同樣柔毛。聚傘花序傘房狀，頂生，長2.5-6厘米，寬49厘米，分枝斜升至近平展，56對，再分枝36回二歧；苞片線形，銳尖，下部的長約2毫米；花萼近二唇，長寬各22.5毫米，被微短柔毛，5齒，近相等，短，頂端圓；花冠連同花管長6毫米，喉部被長柔毛，外面無毛或微被毛，裂片4，上唇長圓形，頂微內(nèi)凹，長2毫米，下唇3圓裂；雄蕊4枚，不伸出花冠外，花絲長達2.5毫米，無毛，花藥干時褐色；子房球形，除頂端有少數(shù)直毛外，其余無毛；花柱長4毫米，柱頭短2裂。核果卵形至球形，徑35（-6）毫米，成熟時黑色，暗晦，核密生瘤突，宿萼杯狀，近二唇形，徑約24毫米.分布及生境：產(chǎn)思茅、西雙版納、河口、富寧等地，海拔500-1200米的陰處常綠闊葉林或路邊疏林中。我國貴州南部、廣西西南部以及泰國北部、老撾、越南（北部至中部）亦有分布。1.1.2豆腐柴的研究現(xiàn)狀 由于豆腐柴在國外野生資源極為稀少，國外關(guān)于豆腐柴的研究尚未見報道，我國豆腐柴野生資源豐富，分布廣泛,但長期以來仍處于自生自滅狀態(tài)，未能得到合理地開發(fā)和利用。目前豆腐柴的研究在國內(nèi)也還沒有引起學(xué)者們的充分重視，其藥用成分、藥理機制、藥品的研制、保健食品和飲料的深加工、果膠的提取工藝和設(shè)備及人工栽培等方面的研究也比較少，還存在許多需要解決的問題,隨著其藥用食用價值開發(fā)的需要，其營養(yǎng)成分、藥用成分研究必將深入，對于豆腐柴的研究也將引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。1.2 POD同工酶1.2.1 POD同工酶概述同工酶（isozyme，isoenzyme）廣義是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)不同的酶。按照國際生化聯(lián)合會（IUB）所屬生化命名委員會（CBN）的建議，則只把其中因編碼基因不同而產(chǎn)生的多種分子結(jié)構(gòu)的酶稱為同工酶。同工酶的基因先轉(zhuǎn)錄成同工酶的信使核糖核酸（mRNA）、后者再轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生組成同工酶的肽鏈，不同的肽鏈可以不聚合的單體形式存在，也可聚合成純聚體或雜交體，從而形成同一種酶的不同結(jié)構(gòu)形式。同工酶是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶。在動、植物中，一種酶的同工酶在各組織、器官中的分布和含量不同，形成各組織特異的同工酶譜，叫做組織的多態(tài)性，體現(xiàn)各組織的特異功能。大多數(shù)基因性同工酶由于對底物親和力不同和受不同因素的調(diào)節(jié)，常表現(xiàn)不同的生理功能，例如動物肝臟的堿性磷酸酯酶和肝臟的排泄功能有關(guān)，而腸粘膜的堿性磷酸酯酶卻參與脂肪和鈣、磷的吸收。對LDH催化的可逆反應(yīng)，心肌中富含的LDH1及LDH2在體內(nèi)傾向于催化乳酸的脫氫，而骨骼肌中豐富的LDH4及LDH5則有利于丙酮酸還原而生成乳酸。所以同工酶只是做相同的“工作”（即催化同一個反應(yīng)），卻不一定有相同的功能。 在生物學(xué)中，同工酶可用于研究物種進化、遺傳變異、雜交育種和個體發(fā)育、組織分化等。例如最原始的脊椎動物七鰓鰻（Lamprey）只有一種LDH肽鏈，進化到較高級的魚類才有A、B兩類肽鏈。又如通過對地理分布不同的物種間某一同工酶譜的普查可以推測物種的地理來源。動、植物的遺傳變異可通過子代和親代同工酶譜的比較來鑒別。法醫(yī)學(xué)中也可用多種同工酶譜的分析來鑒定親子關(guān)系。細胞雜交或植物雜交育種后是否出現(xiàn)新品種也可用同工酶譜的比較來確定。在個體發(fā)育中，從胚胎到出生，再到成年，隨著組織的分化和發(fā)育，各種同工酶譜也有一個分化轉(zhuǎn)變的過程。某型同工酶在胚胎的大多數(shù)組織中出現(xiàn)，成為主要型式，稱為原始型同工酶。但出生后在某些組織中逐漸減少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎組織中幾乎不存在或含量極微，只在分化成熟的少數(shù)組織中存在，稱為成年型同工酶。在植物的不同發(fā)育階段，同樣可見同工酶譜的相應(yīng)改變。 在醫(yī)學(xué)方面，同工酶是研究癌瘤發(fā)生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發(fā)生胚胎化現(xiàn)象，即合成過多的胎兒型同工酶。如果這些變化可反映到血清中，則可利用血清同工酶譜的改變來診斷癌瘤。此外，因同工酶譜有臟器特異性，故測定血清同工酶?？奢^特異地反映某一臟器的病變，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是診斷心肌梗塞較特異的指標(biāo)，較測定血清LDH或肌酸激酶（CK）總活力更為可靠。POD 同工酶是植物體內(nèi)的天然標(biāo)記，它可從分子和生化水平反映機體的各種變化，為植物的品種鑒定、純度分析、抗旱、抗病等方面的研究提供重要的參考價值。1.2.2 POD同工酶研究現(xiàn)狀同工酶技術(shù)作為一種常規(guī)的分析手段 ，已廣泛應(yīng)用于蔬菜的起源、分類、親緣關(guān)系鑒定、遺傳育種、病理和生理等研究領(lǐng)域 ，極大地推動了蔬菜園藝學(xué)科的發(fā)展遺傳性高度雜合的草本植物 ，親緣關(guān)系較復(fù)雜 ，關(guān)于起源和分類問題長期以來爭論不休 ，而同工酶技術(shù)可作為一種常規(guī)手段 ，用來區(qū)分物種、變種和品種 ，并用以評價親緣類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。目前有關(guān)這方面的報道很多。2方案論證2.1實驗方法探討提取蛋白質(zhì)的方法較多，如磷酸緩沖液提取法，Tris-Hcl提取法，水提取法，由于蛋白質(zhì)能溶于水，所以粗蛋白比較容易提取出來，但由于要獲得過氧化物同工酶酶譜，所以要求提取的蛋白質(zhì)含量較高，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)針對POD同工酶，選擇Tirs-Hcl提取法最合適。參照張明坤26的實驗采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳。2.2實驗原理過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。研究表明，植物在發(fā)育過程中，所含同工酶的種類和比例都不相同，它們與植物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定關(guān)系，因此作為基因表達的產(chǎn)物，測定同工酶譜是認識基因存在和表達的一種工具，在植物的種群、發(fā)育及雜交遺傳的研究中有重要的意義。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶，方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性強，測定結(jié)果便于觀察、記錄和保存。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，Nmethylene-bisacylamide，簡稱Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(N，N，N，Ntetramethyl ethylenedia mine，簡稱TEMED)和催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，簡稱AP)或核黃素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)。聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量。3過程論述 3.1實驗過程3.1.1實驗材料的選取 分別選擇A,B,C,D四種生長條件下的黃毛豆腐柴的嫩莖和葉兩個組織進行實驗： A：模擬山間條件，光照50lx，10h，溫度24。B：室內(nèi)條件，光照30lx，16小時，溫度25C：實驗地里，光照100lx，12小時，溫度30D：室外條件，光照150lx，16小時，夏季高溫35。3.1.2實驗儀器儀器：電泳儀、垂直板型電泳槽及附件（玻璃板、硅膠條、梳子、導(dǎo)線等）、微量移液器、TGL-1600離心機、脫色搖床、 量筒：（500ml1，10ml1，5ml1）燒杯：250ml4 其他：玻棒、大培養(yǎng)皿等。3.1.3實驗試劑丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，Tris-HCI緩沖液、Tris-磷酸緩沖液、溴酚蘭、10%過硫酸銨溶液、聯(lián)苯胺，聚乙烯吡咯烷酮，甘油，冰乙酸，3%雙氧水，蒸餾水等。3.1.4實驗步驟3.1.4.1凝膠貯液及電極緩沖液的配制：以下各種試劑的配制，參考趙永芳24和王曉麗25等的方法。 2MTris-HCl pH 8.8緩沖液100ml：稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）24.2g，加入蒸餾水50 mL，用濃HCl調(diào)至pH 8.8后，再用雙蒸水定容至100ml 1MTris-HCl pH 6.8緩沖液100ml：稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）12.1g，加入50 ml蒸餾水，用濃HCL調(diào)至pH 6.8后，再用雙蒸水定容至100mL 。 A液：30%Acr-Bis溶液100ml：稱取29.2g丙烯酰胺（Acr）、0.8g 甲叉雙丙烯酰胺（Bis）用雙蒸水定容至100mL，充分溶解后，用濾紙過濾裝入棕色瓶，并置于4冰箱中保存。B液：分離膠緩沖液100ml：2MTris-HCl pH 8.8 75ml，10%SDS 4ml 蒸餾水21mlC液：1MTris-HCl pH 6.8緩沖液50ml ，10%SDS 4ml，蒸餾水46ml電極緩沖液（Tris-Gly pH 8.3）1L：稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）3.0 g，甘氨酸14.4g。用蒸餾水溶解并定容至1000mL。 10% 過硫酸銨（W/V）：稱取過硫酸銨（AP）0.5g，溶于5mL雙蒸水。用時現(xiàn)配。40%蔗糖溶液（W/V）：稱取4g蔗糖，溶于10mL雙蒸水。1%溴酚藍10ml：稱取100mg溴酚藍，加蒸餾水至10ml，攪拌直到完全溶解， 3.1.4.2蛋白質(zhì)提取液的配制：100ml（過濾除去聚合的染料， 1Mtris-Hcl（pH8.0）15ml，甘油25ml，聚乙烯吡咯烷酮2g，加蒸餾水定容。） 蛋白質(zhì)提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g3.1.4.3提取粗蛋白備用1、稱取1g樣品加入3.5ml提取液 2、把樣品放在研缽中，用液氮研磨后加入提取液在冰上靜置3-4小時3、用離心機離心8000rpm30min4、提取上清液并放冰箱冷藏3.1.4.4凝膠制備及電泳電泳槽的安裝：本實驗使用DYY-型垂直板電泳槽，將配套的玻璃板與膠槽安裝好。分離膠：分離膠10ml成分見下表，按順序取以下各種成分，加入小試管中，混勻并用移液槍緩緩灌入膠室，避免產(chǎn)生氣泡，膠液加至距玻璃板頂部約3 cm處，然后將膠室垂直放置，并用膠頭滴管在分離膠上表面緩緩加入0.5 cm左右的水層。10-20 min后，可以看到膠與水之間有一清晰的界面出現(xiàn)，此時分離膠已聚合，可以繼續(xù)加濃縮膠。表 1 分離膠組成Table 1 Composition of Separation Gel試劑名稱9%12%A液：30% Acr-Bis溶液B液雙蒸水 10% AP TEMED 3ml2.5ml4.5ml50ul5ul4ml2.5ml3.5ml50ul5ul濃縮膠：待分離膠凝聚后，用濾紙吸干水層，并配制8ml濃縮膠。濃縮膠成分見下表，按以下順序在小燒杯中加入各種成分，混勻后倒入膠室，避免產(chǎn)生氣泡，并立即插入樣品梳。約10min后，濃縮膠聚合。小心取下樣品梳，并倒入電極緩沖液（負極緩沖液）。表2 濃縮膠組成Table 2 Composition of Concentration Gel試劑名稱 凝膠濃度（4%）A液：30% Acr-Bis溶液C液雙蒸水 10% AP (mL)TEMED (mL)1.4ml2ml4.6ml60ug10ug加樣及電泳：取100L酶液，加入等量的40%蔗糖，再加入10L 0.025%溴酚藍，混合均勻。用微量進樣器在第個樣品孔里面加入10L樣品，加樣過程中，避免樣品溢出樣品孔。加樣完畢后，將電泳槽放置在4冰箱中，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至150V，待指示劑（溴酚藍）進入分離膠后，穩(wěn)壓200V電泳。染色：聯(lián)苯胺-醋酸-過氧化氫染色液預(yù)先配制1號溶液：2g聯(lián)苯胺溶于18ml冰醋酸，再加72ml去離子水；2號溶液：3%H2O2 電泳結(jié)束時，取1號溶液4ml和2號溶液1.6ml，加入76ml去離子水，即配成一塊膠板所需染色液。電泳后將膠板剝下，用去離子水沖洗清潔，浸入配好的染色液中，在室溫上，顯現(xiàn)藍色譜帶，隨時間的延長，過氧化物譜變?yōu)榧t褐色，然后用水沖洗清潔。最后拍照并繪圖。4結(jié)果與分析4.1水、磷酸緩沖液提取蛋白質(zhì)與Tris-Hcl提取液提取效果的比較1 2 3 1 2 3 水提取法、磷酸緩沖液提取法與Tris-HCI緩沖液提取方法后的染色效果 1 2 3 1 2 3 水提取法、磷酸緩沖液提取法與Tris-HCI緩沖液提取方法酶帶模式圖如上圖所示，1，2，3 是采用室外條件下豆腐柴的葉片，分別用水提取法， Tris-Hcl提取液與磷酸緩沖液提取蛋白質(zhì)提取效果的比較，由此可以看出，用Tris-Hcl提取液提取的效果最好。因此本實驗選用Tris-Hcl提取液提取粗蛋白。4.2四種生長條件下豆腐柴POD同工酶譜分析 5 6 7 8 1 2 3 4 四種環(huán)境下豆腐柴莖、葉POD同工酶譜 POD-A1 POD-A2 POD-A3 POD-A4 POD-A5 POD-A6 POD-A7 POD-A8 POD-A9 POD-A10 POD-A11 POD-A12 5 6 7 8 1 2 3 4 四種環(huán)境下豆腐柴莖、葉POD同工酶譜模式圖 表一：四種環(huán)境下豆腐柴莖、葉POD同工酶條帶數(shù)和酶帶遷移率酶帶遷移率（Rf）=編號12345678POD-A110.110.110.110.110.1POD-A210.1310.13POD-A311POD-A410.3610.3610.3610.3610.36POD-A510.4410.44POD-A610.5710.5710.57POD-A710.5910.59POD-A810.63POD-A910.6610.6610.6610.6610.66POD-A1010.7310.7310.73POD-A1110.7610.7610.7610.7610.76POD-A1210.8310.83總數(shù)15373972 表二： 四種環(huán)境下豆腐柴莖、葉 同工酶譜帶強度表：酶帶編號12345678POD-A1-+ + + + + + + + + + +POD-A2-+ +-+ +-POD-A3-+ +-POD-A4-+ + +-+ +-POD-A5-+ + + +-POD-A6-+ + + + +-POD-A7-+ + +-POD-A8-+ +-POD-A9+ + + + +-+-POD-A10-+ + +-+ +-+-POD-A11-+ + + + +-+POD-A12-+ +-+ 1-8號分別表示：1：山間條件下豆腐柴的莖2：室內(nèi)的莖3：地里的莖4：室外的莖5：山間條件下的豆腐柴葉6：室內(nèi)條件下豆腐柴的葉7：地里的葉8：室外條件下的葉 POD-A1-A12分別表示同工酶譜編號，“”表示譜帶缺失，“”表示譜帶存在，“”的多少表示譜帶強度。4.2.1豆腐柴相同組織的POD同工酶差異如表一所示：1和5、2和6、3和7、4和8都是相同環(huán)境下豆腐柴POD莖和葉的酶帶條數(shù)和遷移率，表二為酶帶強度，由表可以看出，相同條件下豆腐柴莖與葉相比，葉中POD同工酶酶帶要多，且平均遷移率快，酶帶強度大，說明豆腐柴POD同工酶的表達具有明顯的組織間差異。4.2.2四種環(huán)境條件下豆腐柴POD同工酶差異如表一：1-4表示四種環(huán)境條件下的豆腐柴莖的同工酶酶條帶和條帶強度，4號2號3號1號，可知，室外條件（4號）下豆腐柴莖的POD同工酶條帶數(shù)最多，遷移率快，酶帶強度大，山間條件（1號）下生長的豆腐柴POD同工酶條帶最少，5-8分別表示四種環(huán)境條件下豆腐柴葉片的同工酶譜條帶和條帶強度，6號7號5號8號，可知室內(nèi)條件（6號）下豆腐柴的POD同工酶譜最強，條帶最多；室外條件（8號）下豆腐柴POD同工酶條帶最少，酶譜最弱，其次是5號。綜合比較可知山間培養(yǎng)條件（1號和5號）下，豆腐柴組織的POD同工酶含量較少，說明山間條件最適宜豆腐柴的生長。4.3討論4.3.1關(guān)于同工酶在遺傳分析上的優(yōu)點同工酶（等位酶）作為一種重要的遺傳標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，例如探討物種的起源進化，了解植物自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)，探查種群的交配體系，鑒定種質(zhì)資源的特征特性，并為分類提供重要的依據(jù)28,29,30?；诘任煌っ讣夹g(shù)的相似性比較，是解決種內(nèi)和種間變異及物種形成問題的有力工具，它不僅僅是利用遺傳一致度值，還同時結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、細胞學(xué)和地理學(xué)等經(jīng)典資料，將會更清楚地認識物種的進化過程、機制和進化的復(fù)雜性，有助于解決傳統(tǒng)方法所無法解決的難題27。同工酶是由等位基因編碼的，具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和特異性。因此，利用同工酶進行遺傳分析是可靠、可行的。大量研究者通過他們在其它植物上的研究，發(fā)現(xiàn)POD同工酶在進化過程中是高度保守的，而且，與其它同工酶相比，其條帶較豐富。因此，選擇POD同工酶作遺傳分析是可靠的。4.3.2關(guān)于同工酶電泳的一些體會在本實驗過程中，經(jīng)過反復(fù)摸索，筆者發(fā)現(xiàn)許多因素對電泳效果有影響。在酶的提取過程中，提取液的量及提取時間對酶液的濃度有影響；酶對于反復(fù)凍融十分敏感，這可能是由于加快了溶酶體的破裂，導(dǎo)致酶降解失活，或是因為引起酶高級結(jié)構(gòu)的改變所致。在不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，為了達到較好的分離效果，分離膠濃度應(yīng)控制在10左右，POD對凝膠濃度較敏感；濃縮膠長度應(yīng)在1.5-2.0 cm。每次配制的電極緩沖液只能用10次左右，過長時間使用會影響分離效果。為了使條帶清晰，每孔點樣量至少10l，并避免溢出導(dǎo)致相互干擾。經(jīng)過多次比較，結(jié)果表明穩(wěn)壓電泳效果比穩(wěn)流電泳更好，且電壓在200-300V，時間在1h左右。染色過程中，POD染液在原配方的基礎(chǔ)上多加0.5mL聯(lián)苯胺可以加速顯帶，而且效果更好；并且用時現(xiàn)配，染色需要控制好溫度，避光。本研究結(jié)果在實驗條件等方面為今后的豆腐柴同工酶研究及遺傳分析積累了經(jīng)驗。由于此次實驗樣品較少，同工酶標(biāo)記與豆腐柴親緣關(guān)系及等位基因表達的空間差異性還有待進一步的研究。4.3.3關(guān)于豆腐柴POD同工酶的遺傳分析豆腐柴的遺傳多樣性研究對豆腐柴遺傳資源的保存和開發(fā)利用具有重要意義。一直以來、國內(nèi)外開展豆腐柴遺傳多樣性的研究都較少，本實驗對豆腐柴過氧化物酶同工酶進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下其酶譜表現(xiàn)不同，而且會出現(xiàn)明顯的組織差異性。因此，我們認為，過氧化物酶可作為POD同工酶首選的同工酶遺傳標(biāo)記。4.3.4展望為了更系統(tǒng)地了解豆腐柴對環(huán)境的響應(yīng)，還需要進一步完善豆腐柴的同工酶譜資料，增加所測同工酶的種類、增加豆腐柴樣品數(shù)。實踐證明，多個同工酶比較的結(jié)果對于遺傳分析是相互補充的。此外，還需要將同工酶技術(shù)與其他遺傳分析技術(shù)相結(jié)合，互為補充。5參考文獻1 胡能書 ,萬賢國. 同工酶技術(shù)及其應(yīng)用M.長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社 ,1985 ,3047、7085.2 賈守菊 ,張永普 ,陳艷樂,等.中國石龍子的同工酶J .動物學(xué)雜志2002 37(5).3 禹邦超,劉德立. 應(yīng)用酶學(xué)導(dǎo)論M. 武漢:華中師范大學(xué)出版社,1995.2 中國科學(xué)院植物志編輯委員會. 中國植物志:第72 卷 M .北京: 科學(xué)出版社,1988:236- 238.3 畢淑鋒,朱顯靈豆腐柴資源及其開發(fā)利用J林業(yè)實用技術(shù)4 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