




已閱讀5頁(yè),還剩27頁(yè)未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀
版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
.綜述: 質(zhì)粒DNA生產(chǎn)工藝的研究進(jìn)展一、質(zhì)粒DNA細(xì)菌質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一類獨(dú)立于染色體的自主復(fù)制的遺傳成分,除了酵母的殺傷質(zhì)粒(killer plasmid)是一種RNA質(zhì)粒之外,迄今所知的所有質(zhì)粒無(wú)一例外地都是屬于這種類型的DNA分子1,質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài),隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制,并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代2,為了更好地適應(yīng)細(xì)胞的生理特點(diǎn),質(zhì)粒主要以細(xì)長(zhǎng)并具有負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形式存在于原核細(xì)胞中3。環(huán)形雙鏈的質(zhì)粒DNA分子具有三種不同的構(gòu)型:超螺旋型(SC)質(zhì)粒DNA;開環(huán)型(OC)質(zhì)粒DNA和線性(L)質(zhì)粒DNA分子4。用于基因工程改造的質(zhì)粒載體通常包括復(fù)制子、選擇標(biāo)記和目的基因和啟動(dòng)子5,為了獲得高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的質(zhì)粒DNA,在構(gòu)建質(zhì)粒DNA時(shí),需仔細(xì)從以下幾個(gè)方面著手考慮。1. 質(zhì)粒復(fù)制子的選擇Prazeres6報(bào)道到2010年,以質(zhì)粒為核心的基因免疫和治療的市場(chǎng)產(chǎn)值將會(huì)超過450億美元,質(zhì)粒DNA的需求不斷加大。因此,無(wú)論從科學(xué)還是經(jīng)濟(jì)角度出發(fā),在構(gòu)建DNA疫苗和基因治療用途的質(zhì)粒時(shí),為了提高質(zhì)粒產(chǎn)量,復(fù)制子的選擇非常關(guān)鍵,目前,絕大多數(shù)學(xué)者選擇拷貝數(shù)高且僅需宿主編碼蛋白的ColE1復(fù)制子7。在攜帶ColE1復(fù)制子的質(zhì)粒中,RNAII是復(fù)制的正向調(diào)節(jié)分子,RNAI是復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)物,另外,由質(zhì)粒編碼的一種Rop/Rom蛋白可提高RNAI與RNAII結(jié)合的效率,增強(qiáng)RNAI的負(fù)調(diào)控作用,因此,Rop/Rom基因缺失至少可使colE1質(zhì)粒拷貝數(shù)提高3至4倍8。Yavachev 和 Wang 9-10研究報(bào)道非荷載的轉(zhuǎn)移RNA的二氫尿嘧啶環(huán)、反義環(huán)和CCA序列可與RNA I或RNAII的環(huán)有高度的同源性,從而會(huì)影響到質(zhì)粒DNA的復(fù)制,但是其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。據(jù)Minton11報(bào)道,pUC19系列載體同樣被缺失了rop基因,但其與其他缺失rop基因的質(zhì)粒在拷貝數(shù)上的表現(xiàn)卻不盡相同,這是由于pUC質(zhì)粒在RNAII序列上帶有一個(gè)G到A的點(diǎn)突變,可依溫度的不同而改變正向調(diào)節(jié)分子RNAII的二級(jí)結(jié)構(gòu),Chambers S &Yanisch-Perron C等研究表明在42或者45下,RNAII似乎折疊成抗RNAI抑制的構(gòu)型,于是DNA合成的起始加強(qiáng),結(jié)果拷貝數(shù)特別高12-14。盡管構(gòu)建DNA疫苗時(shí)普遍使用ColE1類型復(fù)制子,但Uhlin B & Remaut E報(bào)道的一種由低拷貝發(fā)展而來(lái)的由溫度控制的“失控型”復(fù)制子同樣具有巨大的應(yīng)用前景,這種失控的質(zhì)??墒官|(zhì)粒DNA大量積聚在大腸桿菌中,其拷貝數(shù)可以高達(dá)100015-16,Ansorge M和Chao Y證實(shí)這種拷貝數(shù)已成功地應(yīng)用來(lái)表達(dá)大量的重組蛋白17-18,盡管“失控型”復(fù)制子的優(yōu)勢(shì)非常明顯,但還沒有使用這個(gè)類型復(fù)制子來(lái)構(gòu)建DNA疫苗的成功例子,至今不清楚什么是導(dǎo)致此種復(fù)制子未得到開發(fā)的具體原因19。2. 抗性基因的選擇在選擇抗生素抗性基因時(shí),由于極少量即可引起部分人群強(qiáng)烈的過敏反應(yīng),首先應(yīng)避免-內(nèi)酰胺類抗生素的使用,而應(yīng)考慮氨基糖苷類的新霉素和卡那霉素20,因?yàn)檫@些氨基糖苷類的抗生素在臨床上很少使用,且無(wú)耳毒性、腎毒性等副作用,所以更為合適19。3. 其他元件的考慮設(shè)計(jì)、構(gòu)建DNA疫苗和基因治療質(zhì)粒載體的策略已經(jīng)十分明顯,它除了必須包括一個(gè)能使質(zhì)粒在大腸桿菌中維持、分裂的元件;一個(gè)能促使目的基因在機(jī)體內(nèi)表達(dá)的元件和選擇標(biāo)記外,還包括其他一些調(diào)控元件,以促使轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和質(zhì)粒的穩(wěn)定21,這些元件包括真核啟動(dòng)子、終止子及其終止信號(hào)等,啟動(dòng)子是外源基因在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)獲得表達(dá)的必要前提,常見的有CMVI/E、SV40、EF-1及UbC和MHCI等,CMV比SV4022和UbC23等更為有效,其中內(nèi)含子A更能提高CMVI/E的表達(dá)水平22,CMV現(xiàn)已被廣泛使用在商品化載體上,這對(duì)商業(yè)開發(fā)DNA疫苗來(lái)說(shuō)是十分有幫助的。另外,一些抗原基因本身來(lái)源的啟動(dòng)子也可用來(lái)構(gòu)建DNA疫苗,但對(duì)于想同時(shí)表達(dá)多個(gè)抗原基因的質(zhì)粒而言,此種啟動(dòng)子的效果不明顯;常用的轉(zhuǎn)錄終止子及終止信號(hào)包括牛生長(zhǎng)激素(BGH)、SV40及人-珠蛋白。此外,在構(gòu)建DNA疫苗時(shí),可利用非甲基化的細(xì)菌DNA-CpG寡脫氧核苷酸來(lái)優(yōu)化整個(gè)質(zhì)粒,提高DNA疫苗的免疫原性,這是因?yàn)檎婧松顲pG的概率只有原核生物的1/16左右24,這種頻率上的差異使得其與模式識(shí)別受體TLR-9的相互作用,提高了免疫應(yīng)答水平25。4. 目的基因在選擇和構(gòu)建質(zhì)粒DNA時(shí),首先應(yīng)考慮的是質(zhì)粒DNA可否整合入宿主基因組,因此,在選擇目的基因時(shí),須嚴(yán)格避免目的基因同人類基因組之間具有長(zhǎng)片斷的同源序列;啟動(dòng)子和終止子同樣須認(rèn)真篩選以嚴(yán)格控制其生物學(xué)活性;此外所有構(gòu)建質(zhì)粒DNA的過程需要有詳細(xì)的記錄,且附有基因的序列,宿主菌的表型和基因型鑒定26-32。5. 質(zhì)粒的穩(wěn)定性質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后,必將引起宿主菌生理發(fā)生改變33,質(zhì)粒的復(fù)制增加了宿主菌的負(fù)擔(dān),引起宿主菌生長(zhǎng)速率下降,使得重組工程菌的發(fā)酵過程比非重組菌的發(fā)酵過程復(fù)雜化,進(jìn)而有可能降低質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性;同時(shí),外源基因的插入也會(huì)干擾到質(zhì)粒本身的穩(wěn)定性,在以大腸桿菌為宿主的發(fā)酵過程,還必須考慮到宿主菌的遺傳特性34-36,判定其是否存在可以降解重組DNA,或者產(chǎn)生引起重組DNA的不穩(wěn)定性的蛋白酶或其他一些蛋白分子。5.1 質(zhì)粒不穩(wěn)定性的概念質(zhì)粒不穩(wěn)定性,是指工程菌在生長(zhǎng)過程中重組質(zhì)粒發(fā)生變化,結(jié)果不呈現(xiàn)原有的表型特征。質(zhì)粒不穩(wěn)定可分為兩類:分離不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性37。分離不穩(wěn)定是指在細(xì)胞分裂中由于缺陷分配引起部分或全部質(zhì)粒的丟失;結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定則是由于重組質(zhì)粒DNA上的缺失、插入或重排引起的,質(zhì)粒的分配不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的結(jié)果都將使我們得不到預(yù)期的質(zhì)粒產(chǎn)量和質(zhì)量。如果發(fā)生質(zhì)粒分離不穩(wěn)定,由于部分重組質(zhì)粒的丟失,工程菌的發(fā)酵過程實(shí)際上是工程菌和不含有質(zhì)粒的宿主菌的混合培養(yǎng),Imanaka38證實(shí)在非選擇性條件下,含有重組質(zhì)粒的工程菌的比生長(zhǎng)速率(+)往往小于宿主細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率(-),經(jīng)過25代后,培養(yǎng)液中幾乎都是無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞。5.2 質(zhì)??截悢?shù)質(zhì)??截悢?shù)是體現(xiàn)質(zhì)粒穩(wěn)定性的一個(gè)重要特征,拷貝數(shù)首先決定于自身的遺傳特性,同時(shí)也受到宿主菌生理狀況及生長(zhǎng)環(huán)境的影響,Enberg & Nordstorm39研究認(rèn)為宿主菌生長(zhǎng)速率增大,質(zhì)粒的拷貝數(shù)下降,這可能是高比生長(zhǎng)速率下,質(zhì)粒的復(fù)制速度跟不上細(xì)胞分裂的速度,從而質(zhì)粒拷貝數(shù)不斷下降。此外,Koizumi40的研究同樣證實(shí)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制或缺乏也會(huì)導(dǎo)致質(zhì)??截悢?shù)的下降。一般來(lái)講,質(zhì)??截悢?shù)對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響因質(zhì)粒的不同而不同,F(xiàn)utcher & Cox41對(duì)幾種質(zhì)粒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒穩(wěn)定性隨著拷貝數(shù)的增大而增加,但當(dāng)質(zhì)粒拷貝數(shù)太高時(shí),質(zhì)粒也往往不穩(wěn)定,因多次復(fù)制,增加了出差錯(cuò)的機(jī)會(huì)。5.3 培養(yǎng)方式對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性也起著非常重要的作用,Caulcott 42研究表明質(zhì)粒在以葡萄糖作為碳源時(shí)的丟失頻率大于以淀粉為碳源的培養(yǎng)基。低溫往往有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定地遺傳,而當(dāng)溫度高于50時(shí),重組質(zhì)粒在分批培養(yǎng)的對(duì)數(shù)后期和連續(xù)培養(yǎng)時(shí)均呈現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定狀態(tài)43。5.4 解決辦法在重組基因工程菌發(fā)酵過程中,克服質(zhì)粒丟失的最廣泛使用也是最有效的方法就是添加針對(duì)抗性基因的抗生素。FDA規(guī)定不管在生產(chǎn)還是管理上都應(yīng)用卡那霉素代替氨芐青霉素,其原因是考慮到內(nèi)酰胺類抗生素是一種強(qiáng)烈的過敏原;另外,用抗生素添加法來(lái)消除質(zhì)粒脫落性的不穩(wěn)定性在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)并不可取,因?yàn)檫@種選擇壓力只能維持一段時(shí)間,要從根本上解決這個(gè)問題,需要研究影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的各個(gè)過程(質(zhì)粒的復(fù)制、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移及質(zhì)粒在子代細(xì)胞中的分配等)44;此外,質(zhì)粒的平衡致死系統(tǒng)有可能為徹底摒棄抗生素的使用奠定基礎(chǔ)45。二、菌種庫(kù)的建立對(duì)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的條件進(jìn)行優(yōu)化。建立原始種子庫(kù)。分析種子庫(kù)的遺傳穩(wěn)定性,要明確該種子庫(kù)可以傳代的次數(shù)。在此基礎(chǔ)上建立主細(xì)胞庫(kù)和工作細(xì)胞庫(kù),并應(yīng)保證該類細(xì)胞庫(kù)沒有噬菌體和其它外源因子的污染;并對(duì)細(xì)菌的遺傳背景進(jìn)行分析和檢測(cè),保證細(xì)胞庫(kù)中細(xì)菌的遺傳背景包括基因型、表型未發(fā)生改變;應(yīng)檢測(cè)細(xì)菌的形態(tài)學(xué),保證細(xì)菌的均一性;應(yīng)檢測(cè)導(dǎo)入基因的存在狀態(tài)。并對(duì)工作細(xì)胞庫(kù)的規(guī)模、保存條件、擴(kuò)增條件、傳代過程中質(zhì)粒的穩(wěn)定性(拷貝數(shù)及表達(dá)量)、允許的傳代次數(shù)等進(jìn)行研究。三、含重組質(zhì)粒基因工程菌的發(fā)酵影響質(zhì)粒 DNA 產(chǎn)量的因素最重要的是宿主菌株的遺傳背景和質(zhì)粒分子本身的拷貝數(shù),除此之外,在工業(yè)發(fā)酵中宿主菌株的生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)基類型也是不可忽視的條件。一般建議使用 endA 基因發(fā)生突變的(endA1)大腸桿菌宿主菌株,例如 DH5,JM109,以及 XL1-Blue 等,因?yàn)?endA 基因突變的結(jié)果,使得大腸桿菌宿主細(xì)胞失去了合成具有功能活性的核酸內(nèi)切酶的能力,從而增進(jìn)了所含質(zhì)粒 DNA 分子的穩(wěn)定性46。在典型的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,質(zhì)粒是由大腸桿菌在搖瓶中發(fā)酵生產(chǎn)的,溫度、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)基是唯一可控制的因素47。一般培養(yǎng)物的質(zhì)粒產(chǎn)量在 1-10mg 之間;在高密度培養(yǎng)的發(fā)酵罐中,諸如培養(yǎng)基組成、溫度、pH 值、溶解氧、積累的代謝產(chǎn)物,攪拌速度等影響細(xì)菌及質(zhì)粒產(chǎn)量的因素都能得到監(jiān)測(cè)和控制,質(zhì)粒產(chǎn)量可達(dá)搖瓶的10到50倍48,Lahijani R49的研究數(shù)據(jù)顯示每升培養(yǎng)基可以產(chǎn)出220mg質(zhì)粒DNA,Schmidt T50也表明質(zhì)粒產(chǎn)量可達(dá)225mg/L。高密度培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn),不僅能增加產(chǎn)率,而且也為減少發(fā)酵罐容積、減輕分離純化、減少污水、降低能耗和成本帶來(lái)好處。3.1 培養(yǎng)基的組成大腸桿菌可以在營(yíng)養(yǎng)豐富或貧乏的培養(yǎng)基中生長(zhǎng),但是營(yíng)養(yǎng)物的種類及來(lái)源對(duì)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和數(shù)量都產(chǎn)生重大影響51。由于可生產(chǎn)高的細(xì)胞密度,豐富的、復(fù)合培養(yǎng)物,如酵母膏和/或蛋白水解物很受歡迎,肉膏因?yàn)榭赡芎携偱2〉葎?dòng)物病毒而成為潛在的污染源被排除在外。除了豐富營(yíng)養(yǎng)物,還需加入葡萄糖或甘油等碳源物質(zhì),Korz52研究表明,以甘油為基礎(chǔ)的碳源培養(yǎng)基的生長(zhǎng)速度較慢,幾乎不產(chǎn)生乙酸,終產(chǎn)物也比以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基多,但當(dāng)它們超過一定的范圍時(shí)都會(huì)阻止細(xì)胞的生長(zhǎng),這就解釋了為什么在間歇發(fā)酵中增加營(yíng)養(yǎng)物的濃度并不能得到高細(xì)胞密度的原因。目前,常用的有三種形式的培養(yǎng)基:限制性培養(yǎng)基、半限制性培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基,其可重復(fù)性依次降低。OKennedy53的研究結(jié)果表明,半限制性培養(yǎng)基生產(chǎn)質(zhì)粒pSV的產(chǎn)量為9.12g/mg干菌,比復(fù)合培養(yǎng)基的4-6g/mg干菌高一些。同時(shí), OKennedy54還證實(shí)了用于質(zhì)粒生產(chǎn)培養(yǎng)基最佳的CN為2.781,最大比例不要超過121,因?yàn)樵诖朔秶鷥?nèi),細(xì)菌膜上的肽聚糖的成分沒有發(fā)生改變,不會(huì)影響到化學(xué)裂解的特性,在試驗(yàn)過程中,OKennedy還發(fā)現(xiàn)添加氨基酸后的限制性培養(yǎng)基SDCAS,無(wú)論在提高質(zhì)粒超螺旋的比例上還是在減少質(zhì)粒的丟失率上都比LB培養(yǎng)基的效果好,且SDCAS經(jīng)堿裂解后產(chǎn)生的宿主基因組DNA也明顯減少。3.2 發(fā)酵方式的選擇發(fā)酵一般以分批或者流加的方式進(jìn)行55。在這兩種方式中,流加發(fā)酵可以提高細(xì)胞密度,并因此可能改變質(zhì)粒的質(zhì)量,Matsui56報(bào)道在發(fā)酵過程中添加固體葡萄糖,可以使DCW(dry cell weight)達(dá)到134g/L,質(zhì)粒在細(xì)胞中一般呈現(xiàn)負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu),但據(jù)了解,宿主菌的生長(zhǎng)條件,溶解氧及溫度等的改變都可以改變超螺旋質(zhì)粒的密度57。D.J.Korz58研究證實(shí),溶氧不足或CO2過剩都會(huì)促進(jìn)乙酸形成,促使細(xì)胞衰老和死亡,降低質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。Lahijani59 探討了溫度和流加操作對(duì)質(zhì)粒產(chǎn)量的影響,培養(yǎng)物在連續(xù)流加操作中保持 37直至 OD600達(dá)到某個(gè)數(shù)值后,升溫至 42或 45,這樣可大大提高質(zhì)粒的產(chǎn)量,補(bǔ)料過程中,可盡量使用氨水來(lái)調(diào)節(jié)pH,這樣可以補(bǔ)充氮源。也有實(shí)驗(yàn)指出質(zhì)粒的生產(chǎn)因?yàn)橘|(zhì)粒本身而異,相同發(fā)酵條件下不同的質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)有很大差異;但多數(shù)研究者認(rèn)為,控制細(xì)菌較低的比生長(zhǎng)速率,對(duì)質(zhì)粒的復(fù)制有很大的好處,因?yàn)椋拗骶^快的直接后果是質(zhì)粒復(fù)制跟不上細(xì)菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致拷貝數(shù)下降或者質(zhì)粒丟失。理想的質(zhì)粒收獲階段應(yīng)該是在細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)后期或靜止期前期,此時(shí)RNA轉(zhuǎn)錄,蛋白質(zhì)翻譯的水平處于最低,質(zhì)粒的復(fù)制達(dá)到最高水平。1989年,Reinikainen 60研究小組得出結(jié)論,pH值介于6.2-6.8之間和30的培養(yǎng)溫度有利于ColE1類型復(fù)制子質(zhì)粒產(chǎn)量的提高,此外,添加氯霉素61,氨基酸饑餓62,添加痕量維生素63等都可以提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。四、質(zhì)粒的分離和純化在質(zhì)粒的最終產(chǎn)物中,宿主基因組片段、高分子量的RNA尤其是核糖體RNA和質(zhì)粒的異構(gòu)體不利于質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)染,因此,如何有效消除這些雜質(zhì)尤為關(guān)鍵。因?yàn)橘|(zhì)粒DNA的這種帶負(fù)電荷的多形結(jié)構(gòu)使得它的電荷性和親水性能夠與許多分子如內(nèi)毒素和雜蛋白相結(jié)合,加大了其純化的難度,雖然目前有很多種方法可用來(lái)純化質(zhì)粒DNA,但迄今并沒有一個(gè)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)室未優(yōu)化的條件下,質(zhì)粒產(chǎn)量通常較低,且提取和制備的質(zhì)粒DNA損失嚴(yán)重,不符合FDA等相關(guān)組織機(jī)構(gòu)的條例。除此之外,質(zhì)粒的大規(guī)模提取要考慮到如何降低生產(chǎn)成本,并按照生物制品評(píng)價(jià)和研究中心(Center for Biologics Evaluation and Rrsearch, CBER)下屬的疫苗研究和管理辦公室已有的章程嚴(yán)格執(zhí)行 64。如前所述,質(zhì)粒純化時(shí),主要考慮四種雜質(zhì):gDNA,RNA,蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素。質(zhì)粒的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)除了要除去這些雜質(zhì)之外,還應(yīng)該避免使用有毒,有機(jī)、易燃試劑和動(dòng)物源性的酶試劑65。在保證產(chǎn)率和純度合格的情況下應(yīng)選擇省時(shí)、省成本、省純化工藝的操作流程。所有的操作都應(yīng)該能夠放大到每批生產(chǎn)克級(jí)甚至千克級(jí)的質(zhì)粒。最重要的是,所有過程要有重復(fù)性,這樣才能使生產(chǎn)出的質(zhì)粒一直符合產(chǎn)品規(guī)格。一般的,質(zhì)粒的大規(guī)模純化包括下面幾個(gè)或所有步驟:細(xì)胞裂解,沉淀,酶消化,柱層析(一步或多步),脫鹽或著改變緩沖液,以及無(wú)菌過濾。質(zhì)粒的大規(guī)模生產(chǎn)純化的大致流程如下圖所示66:4.1 細(xì)胞收集細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,必須通過連續(xù)流或者微過濾67對(duì)培養(yǎng)菌體進(jìn)行濃縮,這不僅僅是要對(duì)菌體進(jìn)行濃縮,而且是為了去除對(duì)接下來(lái)的純化有影響的培養(yǎng)基成分。4.2 細(xì)胞裂解細(xì)菌細(xì)胞裂解是純化流程中的關(guān)鍵一步。可以通過多種手段來(lái)完成細(xì)胞的破碎:機(jī)械破碎(珠磨法、滲透壓沖擊等),酶解法,熱裂解和堿裂解法。4.2.1 機(jī)械裂解關(guān)于機(jī)械破碎裂解大腸桿菌以釋放質(zhì)粒的研究表明只有微流體化和珠磨法能獲得完整的質(zhì)粒分子。當(dāng)用微流化器破碎細(xì)胞達(dá)65時(shí),質(zhì)粒最多可以回收35,而用玻璃珠研磨破碎細(xì)胞達(dá)50時(shí)質(zhì)粒分子最多可以回收達(dá)74,用微流化和玻璃珠研磨破碎細(xì)胞后,超螺旋質(zhì)粒在總釋放質(zhì)粒中分別為80和94,增加細(xì)胞破碎頻率將使超螺旋質(zhì)粒減少至10以下68,絕大多數(shù)質(zhì)粒呈現(xiàn)“smear”形狀,為獲得相對(duì)產(chǎn)量較高的超螺旋質(zhì)粒必須降低細(xì)胞破碎率,因此,在規(guī)?;a(chǎn)上,這些破碎方法并不適用。4.2.2 熱裂解Zhijun Wang69等研究認(rèn)為熱裂解具有不需完全破裂細(xì)胞、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便快捷等諸多優(yōu)點(diǎn),其所需設(shè)備一般有蠕動(dòng)泵、去污劑和循環(huán)熱水浴等,但是我們的熱裂解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:靠蠕動(dòng)泵將懸浮在Triton、EDTA中的菌液循環(huán)于沸水浴一段時(shí)間后,得到的菌液粘度太大,不易下一步操作,且含有的宿主基因組DNA太多,因此我們放棄了進(jìn)一步的嘗試。4.2.3 堿裂解目前最受歡迎的細(xì)胞裂解法是由 Birnboim & Doly70提出的堿裂解法,它主要是靠0.2M NaOH、 1%SDS和pH4.8的KAC來(lái)完成的,它的整個(gè)步驟包括我們常說(shuō)的SolutionI、SolutionII、SolutionIII三步,首先是將菌體懸浮在SolutionI中,其中的EDTA比較關(guān)鍵,它起著兩個(gè)作用:(1)鰲合細(xì)胞膜和骨架上的Ca2+、Mg2+,從而使細(xì)胞更易破碎(2)鰲合Mg2+,使得內(nèi)源性DNase沒有Mg2+不能發(fā)揮作用,保持質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性,另外SolutionI中的Tris起著穩(wěn)定pH的作用,葡萄糖起著緩沖防止gDNA斷裂的作用。SolutionII是非常關(guān)鍵的一步,SDS破壞胞膜,釋放菌體內(nèi)容物,同時(shí)也能使絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)和脂肪變性并溶解,NaOH使質(zhì)粒DNA和基因組DNA都變性,而質(zhì)粒DNA由于有特有的拓?fù)涑菪Y(jié)構(gòu),可以在下一步中自然復(fù)性,而基因組DNA則永久變性,在這一步中注意事項(xiàng)是在混勻過程中動(dòng)作必須輕柔,原因是防止局部pH大于13而導(dǎo)致質(zhì)粒DNA不可逆變性和粗暴操作導(dǎo)致的基因組斷裂,局部高濃度的SDS也會(huì)形成鬼帶(ghoast band)71。接下來(lái)的是用SolutionIII進(jìn)行中和,使質(zhì)粒DNA復(fù)性,同時(shí)高濃度的KAC也起到了鹽析的作用,最終形成的SDS-gDNA-蛋白不可溶復(fù)合物而被去除,這一步使得變性的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)變成不溶的,凝乳狀的沉淀,同時(shí)一部分染色體 DNA也沉淀出來(lái),而質(zhì)粒 DNA 仍然呈溶解狀態(tài)。這是因?yàn)槿旧w DNA 和一些蛋白質(zhì)及脂質(zhì)是部分相連的,而質(zhì)粒通常沒有這種連接狀態(tài)。在最終的沉淀步驟,考慮到質(zhì)粒DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是由兩條帶磷酸基的骨架構(gòu)成,存在著互相排斥的可能性,所有可以在其中加入一些NaCl和NaAC等使得DNA更易沉淀,天氣炎熱時(shí)還可降低溫度,以抵消布朗運(yùn)動(dòng)效應(yīng)帶來(lái)的質(zhì)粒不易沉淀的后果。由于SolutionIII中KAC的成本非常昂貴,為了降低生產(chǎn)成本,我們根據(jù)溶液III的原理,摸索了許多種新配方,同樣也能達(dá)到相似的效果,成本卻大大降低,為大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒DNA提供了有力的保證。4.2.4 苯酚、氯仿直接抽提法1999年,Jun Song72等人報(bào)道了用苯酚和氯仿直接抽提培養(yǎng)菌液來(lái)獲得質(zhì)粒DNA的技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)可以大大節(jié)約質(zhì)粒提取的時(shí)間,尤其體現(xiàn)在通量篩選重組克隆時(shí)優(yōu)勢(shì)明顯,但其不能去除宿主基因組DNA。4.3 質(zhì)粒制備液的凈化和濃縮在實(shí)驗(yàn)室水平上,去除細(xì)胞碎片、變性蛋白和核酸沉淀物的辦法通常是離心。然而,這并不適用于質(zhì)粒DNA 的工業(yè)化生產(chǎn)。在工業(yè)操作中,這應(yīng)該由被證明是產(chǎn)生剪切力低的操作來(lái)完成。這是因?yàn)椋旱谝?,?yīng)避免將染色體 DNA 剪切成片段,否則染色體 DNA 將從沉淀中釋放并污染質(zhì)粒;第二,質(zhì)粒在分離過程中也要受到剪切,如果質(zhì)粒分子較大,則可能發(fā)生分子鏈的斷裂。工業(yè)上的離心機(jī)通常采用連續(xù)流加方式操作以達(dá)到高的處理量。進(jìn)入離心機(jī)的流體所產(chǎn)生的離心加速度可能導(dǎo)致剪切,從而打散已經(jīng)沉淀的物質(zhì)和 gDNA。因此,過濾成為比較理想的操作,但是如何防止粘稠的沉淀復(fù)合物不堵住過濾孔還是一個(gè)復(fù)雜的技術(shù)難題。 質(zhì)粒 DNA在大腸桿菌裂解液中只占總核酸的 1%(w/w)73,裂解后,仍然存在大量的 RNA 和蛋白質(zhì),這些都必須在隨后的步驟中被去除,同時(shí)應(yīng)該降低溶液的體積以便于后續(xù)操作。通常的處理方法是過柱法,包括離子交換74、分子排阻75、疏水層析76、三鏈DNA親和層析77;或者通過加入無(wú)水乙醇、異丙醇來(lái)達(dá)到濃縮質(zhì)粒DNA的目的,但無(wú)論是前者還是后者都存在著不足,過柱的速度通常較慢,且質(zhì)粒DNA的電荷性和疏水性與雜質(zhì)RNA、內(nèi)毒素、宿主蛋白都很相似,不易掌握具體的pH和鹽濃度;醇類的濃縮需要的體積很大,無(wú)疑增加了成本,而且有背于不能使用易燃、易爆物品的原則。因此,其他的濃縮方法應(yīng)運(yùn)而生,這包括分子切向流法80,小分子類物質(zhì)如精胺79、十六烷基三甲基溴化銨80、聚電解質(zhì)81等,另外芳香化合物82和MnCL283等都有報(bào)道。4.4 宿主細(xì)胞中核酸和其他內(nèi)容物的組成正常生理狀況下,大腸桿菌宿主細(xì)胞含有水、核酸、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素和小分子和一些離子,其占有含量和種類各不相同,分子量也差異很大,如Atkinson84所述,見表。種類總量(W/W)種類/個(gè)細(xì)胞平均分子量水70118核酸基因組0.51a2.8106轉(zhuǎn)移RNA4.84028核糖體RNA0.93500-1000信使RNA0.3400-800660-990質(zhì)粒DNA113300b蛋白質(zhì)1511008-200內(nèi)毒素510小分子和離子3800-2001a快速生長(zhǎng)的大腸桿菌細(xì)胞中含有4個(gè)基因組分子。b質(zhì)粒分子大小為5kb。4.4.1 RNA粗制的質(zhì)粒DNA中,RNA的含量是質(zhì)粒DNA含量的20倍左右78,因此,如何有效地消除RNA尤其是大分子量的核糖RNA和信使RNA十分重要?,F(xiàn)今,絕大多數(shù)的純化方法都使用了牛源性的RNase A,這有違于禁止使用動(dòng)物源性酶制劑的相關(guān)條例85。2001年,Cooke86有使用表達(dá)RNase A基因的宿主菌來(lái)制備質(zhì)粒DNA的成功報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)室也有使用大腸桿菌分泌表達(dá)的重組牛RNase A來(lái)消除RNase A的成功經(jīng)驗(yàn)(未發(fā)表)。David87 的試驗(yàn)結(jié)果表明在堿性條件下長(zhǎng)時(shí)間孵育也可以很好地消除RNA,但是根據(jù)我們的試驗(yàn)數(shù)據(jù),超螺旋質(zhì)粒DNA的比列嚴(yán)重下降,損害了質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。此外,37利用內(nèi)源性RNase A也可去除40的RNA88,2M的氯化鈣89、5M氯化鋰5等都可成功消除RNA。4.4.2 蛋白質(zhì)粗制質(zhì)粒中雜蛋白的含量也相當(dāng)可觀,一定數(shù)量的雜蛋白除了降低質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率外,可引起機(jī)體的異源免疫反應(yīng),它的去除一直依賴于對(duì)人體和環(huán)境有污染和腐蝕的苯酚、氯仿??紤]到蛋白的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比質(zhì)粒DNA小,Teeters認(rèn)為可以利用分子量上的巨大差異來(lái)去除蛋白質(zhì)92。Russel J 80和 Wahlund81報(bào)道利用CTAB或聚電解質(zhì)與DNA雙螺旋大小溝特異結(jié)合的特性可以選擇性沉淀DNA,而將雜蛋白留在上清中,通過離心就達(dá)到去除蛋白的目的。另外,用離子交換層析91和親和層析柱92等技術(shù)都可以除去蛋白質(zhì),達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的,并取得了很好的純化效果。4.4.3 內(nèi)毒素細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌外膜上的特有結(jié)構(gòu),在細(xì)菌生長(zhǎng)、死亡的過程中被釋放出來(lái),在質(zhì)粒制備過程當(dāng)中,細(xì)胞破碎后,大量的內(nèi)毒素都釋放到溶液中93。由于內(nèi)毒素具有極強(qiáng)的熱源性,少量的LPS就可以引起發(fā)燒、血液循環(huán)障礙甚至休克死亡,因此它的去除顯得十分地重要94。由于內(nèi)毒素常常形成囊狀結(jié)構(gòu),其分子量與質(zhì)粒大小相似,而且電荷性與疏水性都與質(zhì)粒DNA相似,給質(zhì)粒DNA的純化帶來(lái)了很大的麻煩。目前,內(nèi)毒素的去除方法主要分為三大類:一是非選擇性去除,包括活性炭吸附和萃取95,利用分子量差異進(jìn)行的超濾96和pH值差異進(jìn)行的離子交換色譜97,這幾種方法沒有考慮到LPS結(jié)構(gòu)方面的特殊性質(zhì),去除效率較低;二是選擇性去除,主要是指親和色譜法,找出適當(dāng)?shù)呐浠?,將其固載于親和色譜的基質(zhì)上合成出親和介質(zhì),即可成為一種高效能、高選擇性的LPS吸附劑,這些包括組胺、組胺酸類98;多粘菌素B99;聚陽(yáng)離子配基如PEI100,聚-L-賴氨酸101;荷正電聚合物-甲基-L-谷氨酸酯102等;三是特異性去除法,這是根據(jù)LPS結(jié)合蛋白(LBP)的結(jié)構(gòu)和功能,提出的一種內(nèi)毒素去除的特異性配體。4.4.4 基因組DNA符合藥物動(dòng)力學(xué)質(zhì)粒中的宿主基因組DNA的含量必須小于10ng/g質(zhì)粒DNA,在發(fā)酵至純化的過程中,由于酶解和機(jī)械剪切力的作用,宿主基因組非常易斷,而現(xiàn)行的離子交換等各層析法純化質(zhì)粒DNA包括了其不能有效去除宿主基因組DNA和內(nèi)毒素的缺點(diǎn),在消除基因組DNA的試驗(yàn)中,以Levy103 和 Winters104的硝酸纖維膜和硅酸鈣最為有效。4.5 質(zhì)粒純化策略氯化銫密度梯度超速離心是質(zhì)粒純化的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法,但此方法耗時(shí),而且難以擴(kuò)大,并使用了有毒和誘變?cè)噭?,不適合用于臨床的質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)。雖然目前純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)還很不成熟,但一些方法具有很大的吸引力。從目的上來(lái)講,實(shí)驗(yàn)室制備小量的質(zhì)??赡芨嗟膹募兌壬峡紤],但是要大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)粒,除了純度上的問題,還有過程的可放大性,重現(xiàn)性,成本等諸多問題需解決。4.5.1 離子交換色譜離子交換色譜(Ion exchange chromatography, IEC)利用離子交換劑為固定相,是根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離的洗脫層析法。鑒于核酸溶液帶有多聚陰離子,可以采用陰離子交換色譜的方法純化質(zhì)粒 DNA105。DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)使親水性和疏水性基團(tuán)分離,疏水性堿基處于雙螺旋的內(nèi)部,兩條螺旋形糖-磷酸鏈纏繞在雙螺旋結(jié)構(gòu)的外側(cè),從而形成多陰離子、高度水化的親水表面,Stahlberg 等人106提出一種量化理論,假定帶有多電荷的生物分子和離子交換劑表面間的相互作用,可以看作是兩個(gè)帶電荷表面在與緩沖鹽溶液接觸時(shí)的遠(yuǎn)距離靜電作用,固定相表面是帶電荷的基團(tuán),使其表面和溶液之間產(chǎn)生了靜電勢(shì)差,從而具有吸引那些帶有相反電荷的溶質(zhì)分子來(lái)到表面的能力。4.5.2 分子排阻色譜分子排阻色譜,又被稱為凝膠過濾,可以用來(lái)分離不同大小及具有不同流體力學(xué)半徑的分子。與陰離子交換樹脂不同,用作分子排阻色譜的樹脂不和質(zhì)粒或者其它雜質(zhì)結(jié)合,該樹脂包含有具有確定大小的通道。較小的分子比較大的分子更容易進(jìn)入這些孔中,并且由此在柱中的流動(dòng)受到阻礙。既然不用以高濃度的鹽或者有機(jī)試劑來(lái)洗脫質(zhì)粒,分子排阻色譜的操作顯得相對(duì)較為簡(jiǎn)單。洗脫順序與分子大小順序相反,最大的分子最先洗出。分子排阻色譜在將質(zhì)粒DNA從小的RNA片段及被RNA 酶消化的核酸中分離出來(lái)顯得特別有效,它也能被用于移除質(zhì)粒溶液中的鹽、緩沖液和其它低分子量的化學(xué)試劑。分子排阻色譜也可能將質(zhì)粒從比它更大的 gDNA 分子中分離出來(lái),而且,分子排阻色譜在移除內(nèi)毒素方面顯得很有成效。但分子排阻色譜有相對(duì)較低的分辨率,一般要將兩種分子達(dá)到完全的分離需要這兩種分子大小相差至少兩倍。因此,在分子大小上與質(zhì)粒 DNA 相近的染色體 DNA 以及高分子量的 RNA 片段就很難由分子排阻色譜除掉。該基質(zhì)的排阻極限對(duì)蛋白質(zhì)是 100106 Da,對(duì)線性DNA是20kb,對(duì)球狀微粒是 400nm。70的回收率中洗下部分幾乎是純的超螺旋質(zhì)粒 DNA107。4.5.3 疏水色譜大腸桿菌gDNA本身是雙鏈DNA,但經(jīng)堿裂解之后,絕大多數(shù)變成了單鏈,兩條鏈相互分離并部分?jǐn)嗔?,因此疏水堿基暴露,在疏水色譜(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)過程中,質(zhì)粒分子的疏水堿基隱藏在雙螺旋內(nèi)部,與配基的作用力非常微弱,另一方面,高濃度的單鏈核酸,如RNA和變性的gDNA則與配基牢固結(jié)合,同樣道理,變性的質(zhì)粒DNA也暴露了疏水堿基,可以通過HIC去除,LPS通過脂基團(tuán)而與HIC的配體發(fā)生作用,而且只有在降低鹽離子濃度后方可被洗脫,合成的寡核苷酸進(jìn)行的試驗(yàn)表明,單鏈越長(zhǎng),與HIC柱子吸附的時(shí)間越長(zhǎng),說(shuō)明了核酸分子中堿基多少與吸附時(shí)間成正相關(guān)。Diogo108報(bào)道通過此方法可以降低內(nèi)毒素的含量20倍以上,天津大學(xué)的Yuan Li109等人報(bào)道使用HIC來(lái)純化質(zhì)粒pcDNA3.0也獲得了良好的效果。4.5.4 親和色譜親和層析基于連接在固相支持物上的寡聚核苷和引入目標(biāo)質(zhì)粒的特定序列之間形成的三重螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)展起來(lái)110。顯然,這些支持物對(duì)超螺旋構(gòu)型的質(zhì)粒的親和力比對(duì)松弛異構(gòu)體的親和力高?;厥章士筛哌_(dá)62,同時(shí)將RNA和gDNA 的含量降低到檢測(cè)不出的水平。另外,乳糖阻遏蛋白等也能與特殊DNA序列結(jié)合的物質(zhì)小規(guī)模純化質(zhì)粒。不管是寡聚核苷和質(zhì)粒結(jié)合還是特殊的蛋白和質(zhì)粒結(jié)合,親和配體和固定相偶聯(lián),并同質(zhì)粒的目標(biāo)序列相互作用。因?yàn)檫@種結(jié)合是依據(jù)特定序列的,所以親和色譜能夠高效地將質(zhì)粒DNA從蛋白質(zhì),RNA 和非特定DNA中分離出來(lái)。然而,這些方法也只限于小規(guī)模的質(zhì)粒純化。這主要是因?yàn)闃?gòu)建大量的親和樹脂在技術(shù)上有困難,同時(shí)成本很大。此外, Woodgate111 和 Kostal112 分別研究了使用鋅指結(jié)構(gòu)的GST的序列特異性的層析和以溫度誘導(dǎo)金屬調(diào)節(jié)蛋白MerR進(jìn)行質(zhì)粒純化的策略,這兩項(xiàng)研究可以叢細(xì)胞裂解液中直接純化質(zhì)粒DNA,規(guī)模可以放大,特異性好,成本也較低,為今后的質(zhì)粒純化提供了一定的借鑒。4.5.5 芳香層析2003和2004年,Lemmens和Lena M82,113先后報(bào)道了在高濃度離液劑或水化鹽的情況下,使用芳香硫醚為配基的親硫?qū)游鲞M(jìn)行了高質(zhì)量的質(zhì)粒純化,其機(jī)制可能是包括質(zhì)粒DNA在內(nèi)的各種核酸分子在高濃度水化鹽如硫酸銨的存在下,各分子發(fā)生不同程度的濃縮和結(jié)構(gòu)的改變,而恰恰是這種結(jié)構(gòu)的改變促使超螺旋質(zhì)粒DNA可以通過-作用與配基上的芳香基團(tuán)結(jié)合而被純化。4.5.6 去污劑CTAB 是一種陽(yáng)離子表面活性劑,它可以與DNA 分子上帶有負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的靜電相互作用,同時(shí),其碳鏈也可以和 DNA 分子發(fā)生疏水互作用,從而中和帶電的 DNA 分子使它們從溶液中沉淀下來(lái)。向細(xì)胞裂解液緩慢地加入CTAB,一方面,可以選擇性地沉淀質(zhì)粒DNA;另一方面,蛋白質(zhì)、RNA和脂多糖等雜質(zhì)保持完全溶解的狀態(tài)。質(zhì)粒沉淀后,可以往沉淀中加入濃的氯化鈉溶液來(lái)去除 CTAB。質(zhì)粒沉淀物中還含有少量 gDNA,但是如果加入的氯化鈉的量控制得很精確,就可以只溶解質(zhì)粒 DNA,而 gDNA 仍然保持沉淀狀態(tài)。在使用 CTAB 沉淀純化質(zhì)粒 DNA 后,質(zhì)粒的純度達(dá)到 90,再用鹽溶液溶解之后,質(zhì)粒純度達(dá)到 9980。使用這種方法大規(guī)模純化質(zhì)粒的關(guān)鍵在于 CTAB 及 NaCl 的加入應(yīng)該做到精確控制。因此,在線實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)顯得必不可少。2005年,*學(xué)者Chowdhury報(bào)道使用兩性去污劑十二烷基二甲酯氨硫璜丙烷和堿來(lái)純化高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA114,其作用原理可能是去污劑使蛋白分子等雜質(zhì)隨機(jī)組裝從而形成可見的“軟”沉淀,而質(zhì)粒DNA則通過靜電作用被包裹并與雜質(zhì)形成分離,并由于兩性去污劑獨(dú)特的作用溶解在可溶相中。4.5.7 濃縮沉淀劑常規(guī)的質(zhì)粒DNA純化方法耗時(shí)長(zhǎng)、使用了吸附劑、核酶和過濾介質(zhì)等,限制了質(zhì)粒DNA的規(guī)?;崛 ?999年,Jamie115報(bào)道了使用濃縮沉淀劑來(lái)選擇沉淀質(zhì)粒DNA的原理,該類沉淀劑是小的陽(yáng)離子分子,可以與雙鏈DNA的大溝和小溝相結(jié)合,縮小DNA體積4-6倍,同時(shí)還起到包裹DNA的作用,在其濃縮沉淀質(zhì)粒DNA的過程中,一般都在低的鹽離子下進(jìn)行。當(dāng)其與大、小溝上的磷酸基團(tuán)相互作用,周圍的DNA分子都發(fā)生濃縮時(shí)即可發(fā)生沉淀,而且,這些分子不但減少了雙螺旋之間的排斥作用,還使其相互連接。這種應(yīng)用最早是Hoopes和McClure116在用精胺和亞精胺從小分子中沉淀大分子DNA的試驗(yàn)中被證實(shí),最初鮭精DNA,Pbgs19Luxwt(6.0kb)均在低離子濃度下被沉淀,而在600mM的NaCl中未出現(xiàn)沉淀。Mourich79于2004年也有用精胺純化pTH.HM的報(bào)道,并比較了其與QIAGEN公司無(wú)內(nèi)毒素試劑盒純化質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率,成本為3.16美元/毫克質(zhì)粒。Bloomfield和Shenoy報(bào)道的MnCl283與精胺一樣,同樣可以通過與DNA大小溝結(jié)合來(lái)分離和純化質(zhì)粒DNA。4.5.8 磁性分離法2005年,中國(guó)臺(tái)灣的Chen-Li Chiang117-118連續(xù)報(bào)道了使用化學(xué)方法制備微小顆粒Fe3O4,并用多聚陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)包裹,將其置于磁場(chǎng)下,通過順磁性可以從細(xì)菌裂解液中直接純化質(zhì)粒DNA,這種磁性顆粒在磁場(chǎng)下,具有磁性強(qiáng)和低毒性的特點(diǎn),在生物領(lǐng)域備受關(guān)注,嚴(yán)格來(lái)講,只有在磁場(chǎng)中,它們才呈現(xiàn)磁性,而且這個(gè)特性使得其可重新分散和重復(fù)利用。金屬可以鰲合氨基酸從而來(lái)純化蛋白,現(xiàn)發(fā)現(xiàn),金屬同樣可以鰲合暴露出的嘌呤堿基而與單鏈核酸結(jié)合而與質(zhì)粒DNA分離,Balan119等研究證實(shí),用銅載的多聚N異丙基聚丙酰烯胺和乙烯基咪唑,可以從宿主菌裂解液中特異吸附RNA分子,從而達(dá)到純化質(zhì)粒DNA的目的,先前質(zhì)粒DNA的純化大都依靠吸附、密度或結(jié)構(gòu)差異從基因組DNA、RNA和蛋白質(zhì)中分離質(zhì)粒,用金屬來(lái)分離純化核酸的報(bào)道非常少見,鰲合配基如次氮基三乙酸和亞胺酸與二價(jià)金屬離子偶聯(lián),通過-d的軌道重疊,與芳香氮具有高親和力,從而達(dá)到純化效果。4.5.9 雙水相分離質(zhì)粒DNA1962年,Albertson120是最早利用雙相分離法生物分子的研究工作者之一,但是該技術(shù)在質(zhì)粒DNA純化上的進(jìn)展緩慢,1978和1991年才由Ohlsson121和Cole122報(bào)道了兩個(gè)研究報(bào)道。直至2002年,Ribeiro123系統(tǒng)描述了用PEG/磷酸鹽的兩相法純化質(zhì)粒DNA的報(bào)道,并證明用PEG600和PEG1000與磷酸鹽組成的兩相分離體系的回收率高,雜質(zhì)少,具有喜人的前景,隨后兩年,Trindade124 和Kepka125也分別有用兩相分離法純化質(zhì)粒DNA的報(bào)道。4.5.10 分子切向流Tangential flow filtration(TFF)技術(shù)主要利用質(zhì)粒DNA、RNA、基因組DNA等分子的大小不同,濾掉RNA和蛋白質(zhì)等小分子,而將質(zhì)粒DNA保留在膜上,使用TFF的主要注意事項(xiàng)是跨膜壓、膜孔和緩沖液的傳導(dǎo)性。Eon-Duval78使用TFF技術(shù)成功地純化了含有乙肝表面抗原基因的質(zhì)粒(7.7kb),David使用TFF技術(shù)純化了6種質(zhì)粒DNA,RNA的去除率達(dá)99以上,蛋白質(zhì)的消除也大于95。除了以上列舉的方法之外,還有許多改進(jìn)的純化策略,如使用膜126(membrane)和盤127(monolith)制作的色譜技術(shù),一改以往柱吸附效率低下,不適合規(guī)?;a(chǎn)的缺點(diǎn)。五、質(zhì)量控制及檢定的要求基于質(zhì)粒 DNA 的生物藥劑是高度化學(xué)限定的,因此能用化學(xué),生化和物理試劑對(duì)其進(jìn)行分析。為確保產(chǎn)品符合規(guī)格而分析所制備的質(zhì)粒的安全性、效力及純度是使整個(gè)生產(chǎn)流程得以建立的關(guān)鍵問題。評(píng)價(jià)用作基因治療和 DNA 疫苗的 DNA 產(chǎn)品的純度,安全性及效力的主要標(biāo)準(zhǔn)和推薦試劑如下所示:5.1 產(chǎn)過程中質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)的建立及要求在生產(chǎn)工藝的各個(gè)環(huán)節(jié)和步驟中對(duì)其產(chǎn)品均應(yīng)建立相應(yīng)的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn),以便后續(xù)工藝的進(jìn)行。由于各種方法的工藝不同,所制定的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)和在何步驟進(jìn)行監(jiān)控可能不同,但其原則是保證產(chǎn)品的質(zhì)量、工藝的連續(xù)性和穩(wěn)定性。5.2 產(chǎn)品的質(zhì)量檢定與要求外觀檢查:根據(jù)樣品的特征建立外觀的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),高純度的質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)生魚肉透明狀,pH一般為7205。純度:主要是評(píng)價(jià)純化的重組DNA制品中是否含有宿主RNA、DNA、內(nèi)毒素和蛋白的污染。一般采用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)制品中有無(wú)RNA,要求無(wú)明顯的RNA帶型;采用Northernblot或熒光定量PCR的方法檢測(cè)制品中殘留的宿主DNA的含量,在該方法的研究時(shí)應(yīng)建立宿主DNA的標(biāo)準(zhǔn)品,并對(duì)該類試劑的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。要求DNA制品中殘余的宿主DNA含量不超過0.01g/g 質(zhì)粒。可以二辛可寧酸法檢測(cè)制品中宿主蛋白的殘余量,在該方法的研究過程中應(yīng)建立宿主蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)檢測(cè)方法的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證,其性能能滿足該實(shí)驗(yàn)的要求,宿主蛋白的含量應(yīng)不超過0.001g/g質(zhì)粒DNA??梢詸z測(cè)樣品在波長(zhǎng)為260nm和280nm的紫外吸收值,并計(jì)算A260/A280的比值,評(píng)價(jià)制品的總體純度,要求其比值在1.75-1.85之間。質(zhì)粒大小的均一性和結(jié)構(gòu)的分析:主要是分析超螺旋結(jié)構(gòu)與線性和松弛性質(zhì)粒的比例,一般采用瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)制品進(jìn)行電泳分析,并用掃描儀對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行掃描,分析各帶型所占的比例,一般要求環(huán)狀結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒所占的比例在90%以上。鑒別實(shí)驗(yàn):主要是對(duì)重組質(zhì)粒的特征以及是否含有正確的插入片段進(jìn)行分析。至少用三對(duì)以上限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切,對(duì)酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳分析,觀察是否有特征性的帶型;用PCR方法對(duì)插入片段進(jìn)行擴(kuò)增或用特征性的酶切方法分析插入的基因片段的大小是否與預(yù)計(jì)的大小一致。體外效力實(shí)驗(yàn):體外轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,檢測(cè)其表達(dá)量,需建立定量檢測(cè)表達(dá)抗原的方法以及表達(dá)抗原的定量標(biāo)準(zhǔn),還應(yīng)檢測(cè)表達(dá)抗原的圖譜,其各表達(dá)目的抗原的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)大小相同,應(yīng)建立相應(yīng)的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。制定各表達(dá)抗原的量和圖譜的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)菌實(shí)驗(yàn):應(yīng)檢測(cè)需氧菌、厭氧菌以及支原體等,制品中應(yīng)無(wú)該類微生物的污染。熱原實(shí)驗(yàn):主要檢測(cè)制品中有無(wú)熱原物質(zhì),可用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌的內(nèi)毒素,要求內(nèi)毒素的含量不高于01EU/ug;也可以用其它方法如家兔試驗(yàn)檢測(cè)制品的熱源。抗生素及其它添加物質(zhì)殘余量的檢測(cè),由于DNA載體一般使用抗菌素的選擇性標(biāo)記,重組DNA的研制和制備過程中采用含抗菌素的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在純化制品中對(duì)抗菌素的含量應(yīng)進(jìn)行限制,因此,應(yīng)建立檢測(cè)抗菌素的檢測(cè)方法并制定抗生素殘留量的要求。在重組DNA的培養(yǎng)和純化工藝中,可能需要一些其它物質(zhì)或基質(zhì),如純化工藝中可能需要乙醇,這些物質(zhì)可能對(duì)人體有潛在的危害,應(yīng)在純化制品中限制其含量,因此,應(yīng)建立檢測(cè)方法并制定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)。安全性實(shí)驗(yàn):該實(shí)驗(yàn)是控制該類制品質(zhì)量的重要指標(biāo),由于該制品與一般生物制品相比又有其特殊性,因此,在安全性方面除了考慮一般的安全性實(shí)驗(yàn),還應(yīng)考慮該制品的特異性安全性。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):由于DNA超螺旋結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性,而且超螺旋結(jié)構(gòu)的比例多少可能影響重組DNA的轉(zhuǎn)染率,因此,在該類制品的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中應(yīng)主要考慮超螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。應(yīng)建立檢測(cè)超螺旋質(zhì)粒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法,并建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。生物效價(jià):由于用于預(yù)防的DNA制劑所發(fā)生作用的原理不同,評(píng)價(jià)其生物效價(jià)的方法也不同。如果DNA制劑是通過免疫反應(yīng)發(fā)生作用的,則應(yīng)評(píng)價(jià)其體液免疫和細(xì)胞免疫的生物效價(jià)。在評(píng)價(jià)體液免疫效價(jià)時(shí),應(yīng)選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品系,建立檢測(cè)動(dòng)物血清抗體的診斷試劑,并對(duì)該類試劑進(jìn)行驗(yàn)證,可以計(jì)算小鼠ED50以及抗體產(chǎn)生的滴度,如有必要和可行,還應(yīng)當(dāng)建立評(píng)價(jià)抗體質(zhì)量的方法,對(duì)抗體的質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià);在評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫效價(jià)時(shí),應(yīng)當(dāng)建立檢測(cè)評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫的方法(如特異性CTL反應(yīng)的方法或Elispot方法等),也可通過對(duì)細(xì)胞因子的定量檢測(cè)評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫情況,如屬于常規(guī)檢定項(xiàng)目,該類方法應(yīng)穩(wěn)定、重復(fù)性好、可操作性強(qiáng),并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。若有動(dòng)物模型,可進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。佐劑或呈遞物質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià):如在最終重組DNA制品含有佐劑或呈遞物質(zhì),則應(yīng)建立檢測(cè)該類物質(zhì)的量以及與重組DNA結(jié)合率的方法,并制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。六、質(zhì)粒DNA的應(yīng)用伴隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展,DNA疫苗及基因治療的優(yōu)勢(shì)已被在多個(gè)領(lǐng)域證實(shí),而DNA疫苗和基因治療最終必需是依賴質(zhì)粒的形式來(lái)發(fā)揮作用。6.1 DNA疫苗DNA疫苗是上世紀(jì)九十年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù),即將外源基因克隆到真核表達(dá)載體上構(gòu)建DNA疫苗質(zhì)粒,DNA疫苗經(jīng)過各種途徑注射到動(dòng)物基體內(nèi)后,可被宿主細(xì)胞吸收和攝取,進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄成mRNA,再在胞漿中翻譯成蛋白質(zhì)。其中一部分蛋白質(zhì)在降解后與MHC類分子結(jié)合,并被遞呈到細(xì)胞表面被CD8 T細(xì)胞的受體識(shí)別,而激活細(xì)胞毒T細(xì)胞的活性;另一部分蛋白質(zhì)也可以分泌出去,再像外源蛋白一樣被抗原提呈細(xì)胞攝取,在吞噬溶酶體內(nèi)降解成多肽,并進(jìn)一步與MHC類分子結(jié)合,有抗原提呈細(xì)胞提呈到細(xì)胞表面被Th2細(xì)胞的受體識(shí)別,然后由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子作用于B細(xì)胞,而刺激以抗體產(chǎn)生為主的體液免疫4。DNA疫苗不僅可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,而且可誘導(dǎo)強(qiáng)烈而持久的細(xì)胞免疫,還可避免向外界排毒,而且DNA疫苗與減毒和弱毒疫苗不一樣,其不存在毒力反強(qiáng)等問題。其安全性及高效性是傳統(tǒng)疫苗所達(dá)不到的,所以,該技術(shù)在病毒、細(xì)胞內(nèi)寄生所引起的傳染病、寄生蟲以及腫瘤防治中顯示出巨大的潛力。Wolff128首先對(duì)重組質(zhì)粒可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)進(jìn)行了報(bào)道,外源蛋白可以在小鼠體內(nèi)表達(dá)長(zhǎng)達(dá)60天,提示質(zhì)粒DNA可以在體內(nèi)相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行表達(dá),可以用作治療性作用,并頓時(shí)引起了廣泛的研究。6.2 基因治療基因治療對(duì)于癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、阿耳茨海默氏病等因?yàn)樘囟ɑ蚧顒?dòng)異常而引起的疾病的預(yù)防和治療很有前景8。該療法是一種將核酸引入人細(xì)胞以用來(lái)修改它們的遺傳特性而達(dá)到治療目的的治療策略。通常,該核酸是能夠編碼起治療作用,破壞作用或者標(biāo)記作用的蛋白質(zhì)的雙鏈 DNA分子(dsDNA)。該核酸也可能是與宿主細(xì)胞里的目標(biāo)序列結(jié)合,通過阻止 mRNAs或者啟動(dòng)子來(lái)抑制特定基因表達(dá)的反義 RNA 或者單鏈 DNA(ssDNA)。至今,以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的基因治療、癌癥疫苗等已經(jīng)超過了600例,質(zhì)粒DNA的基因免疫模擬了病原體在細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)途徑,已經(jīng)成功地應(yīng)用來(lái)治療下肢的局部缺血,心血管再生,并極有希望通過核酸疫苗來(lái)預(yù)防現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的疑難雜癥,包括瘧疾、艾滋病、乙肝和結(jié)核病等。對(duì)于基因治療,質(zhì)粒不能整合入基因組DNA也許是個(gè)缺點(diǎn),但是質(zhì)??梢愿郊芋w的形式存在于細(xì)胞核中,也可以持續(xù)表達(dá)相當(dāng)長(zhǎng)的一
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 城市管理專員考試的主要內(nèi)容及答案
- 2025年藝術(shù)創(chuàng)作與文化傳播基礎(chǔ)知識(shí)考試卷及答案
- 2025年職業(yè)院校教師教學(xué)能力測(cè)評(píng)試卷及答案
- 2025年現(xiàn)代企業(yè)管理與創(chuàng)新能力測(cè)試考試卷及答案
- 2025年文化產(chǎn)業(yè)與創(chuàng)意經(jīng)濟(jì)知識(shí)考試卷及答案
- 2025年心理咨詢師執(zhí)業(yè)考試卷及答案
- 2025年社會(huì)保障政策與法規(guī)考核試卷及答案
- 2025年食品安全管理考試試題及答案
- 2025年人力資源管理師職業(yè)考試題及答案
- 2025年家庭教育指導(dǎo)師職業(yè)資格考試卷及答案
- 毛皮鞣制加工工藝優(yōu)化
- 小米創(chuàng)業(yè)思考
- 鐵礦礦石的市場(chǎng)定位與銷售渠道
- 2024屆甘肅省蘭州市西北師大附中物理高二第二學(xué)期期末經(jīng)典試題含解析
- 坍塌事故培訓(xùn)課件
- 提升機(jī)安全操作規(guī)程
- 自然辯證法概論-第4章(2018新大綱)
- 企業(yè)安全生產(chǎn)自查臺(tái)賬
- ★教導(dǎo)型組織模式思想管理二
- 智能網(wǎng)聯(lián)汽車技術(shù)PPT完整全套教學(xué)課件
- 數(shù)學(xué)精彩兩分鐘-二年級(jí)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論