免疫組化染色技術.doc

此文檔收集于網(wǎng)絡，如有侵權，請 聯(lián)系網(wǎng)站刪除分享 免疫組織化學染色技術 法醫(yī)學院 官大威第一節(jié) 常規(guī)組織學染色技術概述宏觀微觀超微結構基因水平組織形態(tài)學研究技術的種類：一、病理大體組織標本的染色方法在標本制作中，為了某種特殊目的，突出顯示標本的重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對標本進行染色，將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便于區(qū)分大體標本的不同成分和病變特點，如：.脂肪組織染色法目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動脈粥樣硬化大體標本的染色試劑：蘇丹或蘇丹結果：病變處脂肪組織呈橙黃色.早期心肌梗死染色法目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域試劑：0.1% NBT(硝基四唑藍) / 0.2 mol / L PBS(pH 7.6)方法：將2-3 mm 厚新鮮心肌大片放入試劑中，37 C 孵育20 min。結果：正常心肌呈藍色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結締組織、瘢痕組織呈淺藍色或不顯色。注意：新鮮標本，尸檢心肌不超過6小時。二、光學顯微鏡下的組織學染色方法.常規(guī)HE染色（hematoxylin and eosin staining）.組織學特殊染色1. Mallory 三染色、Masson三染色2. 神經(jīng)纖維的鍍銀染色3. 其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細胞DNA和RNA的染色等上述的各種染色方法只能在細胞水平上顯示組織結構的形態(tài)改變。三、超微結構的觀察.光線波長的限制，光學顯微鏡的分辨率極限為0.2m有效放大倍數(shù)最高不超過2000倍。電鏡的分辨率最佳可達0.14nm，放大倍率最高可達100萬倍。第二節(jié)免疫組織化學染色技術 Immunohistochemical technique 由于該技術主要是用于研究和觀察細胞中的某些結構或分子物質和組織細胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細胞化學技術。根據(jù)標記物的不同，免疫細胞化學技術可分為：1. 免疫熒光細胞化學技術2. 免疫酶細胞化學技術3. 免疫鐵蛋白技術4. 免疫金-銀細胞化學技術5. 免疫電子顯微鏡技術一、免疫組織化學染色方法的原理.抗原（antigen）1. 定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，并能與免疫應答產生的效應物質（抗體和效應細胞）在體內或體外發(fā)生特異性結合反應的物質?？乖哂袃煞N性能：（1）免疫原性（immunogenicity）指抗原分子具有誘導機體產生免疫應答的特性。（2）反應原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體或效應T 細胞等免疫應答產物發(fā)生特異性反應的特性。2. 抗原的分類-完全抗原、半抗原免疫學分類胸腺依賴抗原與非依賴抗原外源性抗原：微生物、花粉等內源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫瘤相關抗原等臨床分類同種異型抗原：人類白細胞抗原、血型抗原異嗜性抗原：人與其他動物、植物等之間存在的共同抗原.抗體（antibody）1. 定義：機體受到抗原刺激后，通過體液免疫應答，B淋巴細胞活化、增殖，分化為漿細胞，由漿細胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應的球蛋白，稱為抗體。大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國際免疫學聯(lián)合會正式將化學結構相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。2. 抗體的種類:五類，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM免疫組織化學染色技術中，使用的抗體主要是IgG，個別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。.免疫組織化學染色的反應原理及顯色原理1. 免疫組織化學染色的反應原理.染色反應的最基本原理是抗原抗體的反應。.通過對針對標本中相應抗原的抗體上標記某種發(fā)色劑或酶類，再通過激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標本中抗原抗體反應的部位產生肉眼可觀察到的顏色以確定所要檢測的抗原是否存在。.通過免疫組織化學染色技術，在光學顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白分子類物質的存在與否。2. 免疫組織化學染色的顯色原理(1) 基本原理熒光標記或酶標抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標抗體法應用最為廣泛。n直接法：是將酶直接標記在第一抗體上，用酶標抗體與切片上待檢測的組織或細胞中抗原反應，再用底物顯色，顯示出所檢測的目的抗原的部位。n間接法：是將酶標記在第二抗體上，檢測組織或細胞內的特異性抗原物質。.間接法中所用的一抗是針對組織或細胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體，單克隆抗體是由小鼠制備的。.第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來自同一種屬動物，同標記的第二抗體結合就能用來顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標記每一種第一抗體的麻煩。.通過某種技術增加第二抗體上標記酶的含量，可提高免疫組織化學染色的敏感度。IHC技術中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基本程序1抗孵育切片或細胞涂片2抗（酶標抗體）孵育切片發(fā)色劑顯色（核復染）（3）酶標抗體法的顯色原理及顯色劑.辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）HRP + H2O2 HRP H2O2HRP H2O2+ DH2HRP + D + 2H2OHRP催化的酶促反應第一步是特異的，其余反應是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應的終產物呈現(xiàn)不同的顏色，如：CN（4-chloro-1-naphthol）為藍色TMB（tetramethyl-benzidine）為深藍色AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）為紅色DAB（3，3-diamino benzidine）為棕色.堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)是以AS-Mx為底物，F(xiàn)B/FR (Fast blue/Fast red)為發(fā)色劑，生成藍色/ 紅色不容性沉淀物。.ALP標記的抗體主要用于內源性過氧化物酶含量較高的血細胞、淋巴細胞等的ICC染色。.由于組織細胞內含有內源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑(levamisole)，大多數(shù)內源性ALP活性可被抑制。.葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD ) 是以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、NBT 6.7mg、PMS (phenazinemethyl-sulfate ) 0.167mg、0.05mol/L PBS (pH 8.2) 10.0ml，37oC孵育1小時，生成藍色不溶性沉淀物，該終產物不溶于有機溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長期保存。（4）核復染在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進行核復染，經(jīng)水化后細胞核顯示藍色，與胞質中的DAB棕色形成對比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復染，因為配制蘇木素染料中使用酒精作為介質，可使AEC的紅色終產物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第三節(jié)免疫組織化學染色步驟（一）ABC或SP法進行石蠟切片染色的主要步驟1. 組織材料的采??；2. 組織塊的固定；3. 組織塊的脫水、透明及石蠟包埋；4. 石蠟切片的制備；5. 石蠟切片的脫蠟及水化；6. 抑制內源性過氧化物酶活性；7. PBS洗滌切片；8. 抗原修復或蛋白酶消化切片，修復或暴露抗原；9.PBS洗滌切片；10. 用與二抗來源相同的動物非免疫正常血清(或同時加入BSA)孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11. 用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12. PBS(可加入Tween 20#，PBST)洗滌切片；13. 用針對一抗的生物素化的二抗孵育切片；14. 用PBS或PBST洗滌切片；15. 滴加SP試劑或ABC試劑；16. PBS或PBST洗滌切片；17. DAB或AEC顯色；18. 自來水洗滌切片，終止顯色；19. 用蘇木素做核復染；20. 切片脫水、透明，樹膠封片。（二）各染色步驟的具體操作及注意事項1. 組織材料的采取活檢組織組織標本手術切除標本尸檢標本實驗組織或培養(yǎng)細胞.活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內窺鏡鉗取的組織體積小，因活檢鉗直接鉗取，常受壓過度而變性，因此，活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時應采取主要的病灶區(qū)。.抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標本應考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠距病灶的正常區(qū)。.尸檢組織由于取材時一般均已超過死亡后2小時以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在24小時以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴重，而影響染色結果。手術切除的組織較新鮮，取材后應立即固定，以保存組織結構和抗原。.實驗動物標本新鮮，可按需要取材，特別是很多情況下是在灌流固定后取材，組織結構和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學染色。.取材標本的大小尸檢組織材料大小以1cm1cm 0.2cm 為宜。實驗動物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標本體積不宜過大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費試劑。2. 組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類較多，常用的有以下幾種：.4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4)配制方法：10 ml 40% 甲醛(formalin) + 90ml PBS使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，還可形成甲酸，影響染色結果。.4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4)配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB (pH 7.2-7.4)，攪拌、加熱至60 oC，同時滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷卻后用1N HCl 調PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB將溶液加至1000ml。.固定時間：一般根據(jù)組織塊大小及性質，固定2-24小時。.固定原理：甲醛通過使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產生固定作用。甲醛與蛋白質中的許多氨基酸反應，并能保存脂類和類脂體。.不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測的抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結合。（2）水洗.沖洗時間與標本的種類、組織塊的大小和固定時間長短有關。尸檢組織和大動物組織一般沖洗24小時，小動物組織沖洗2-10小時。新鮮標本固定時間短，沖洗時間也相應縮短，固定時間長的標本，沖洗時間也需延長。沖洗時組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎緊，防止組織塊漏出。用一根適當?shù)哪z管，一端接自來水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或將組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內沖洗。對于過小組織或穿刺組織和小動物組織多次換水浸泡即可。3. 組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強，并可硬化組織。酒精對組織的穿透速度很快，對組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過度收縮，應從低濃度開始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或4oC下進行，以減少抗原的損失。70% 80% 90% 95% 100% 100%（2）透明.為使石蠟能浸入組織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過一種既能與酒精形容，又能溶解與石蠟的溶劑。通過溶劑的媒介作用而達到石蠟浸入組織塊的目的。.透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用二甲苯。.一般經(jīng)過2-3次純二甲苯溶液透明，每次10-15分鐘，同時也應根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調整，不應機械照搬。（3）浸蠟組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內浸漬的過程稱浸蠟。為使石蠟充分滲入組織只，常需經(jīng)過2-3次石蠟浸漬。用于免疫組織化學染色的組織塊浸蠟應使用低溫蠟，在60 oC以下浸透。（4）包埋浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。4. 石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作防脫片劑：APES（3-aminopropyltriethoxy silane）、多聚賴氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明膠。APES涂片的制作原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過對玻璃表面起化學修飾作用，改變其表面的化學物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時間較久。具體操作方法：將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬；將干凈的載玻片放入丙酮內5min；.將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml APES+50ml丙酮）1-2次；純丙酮內洗2次后，37 oC過夜，干燥；用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。.多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL）試劑配制：PLL 0.5g + 蒸餾水100 ml 也可根據(jù)提供的方法配制?？捎? oC或-20oC保存?zhèn)溆?，可反復凍存，效果無明顯影響。.涂片前將其稀釋10-50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻片上，37 oC下干燥過夜。.甲醛-甘油明膠.試劑：40%甲醛2.5ml，明膠0.5g，蒸餾水加至100ml。.配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補充蒸餾水至100ml，混勻即可。粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復或酶消化后，有時易脫片。（2）制做切片.切片機：旋轉式或滑動式切片機。.切片厚度：5-7m。.展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展開切片（水浴鍋上加熱平皿）。.撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。.切片干燥：37 oC過夜，干燥。5石蠟切片的脫臘及水化.脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯、各15分鐘脫臘，.水化：100%酒精、中各10分鐘、95% ALC 5分鐘、90% ALC 5分鐘、80% ALC 5分鐘、70% 6清除內源性過氧化物酶活性由于常規(guī)免疫組織化學染色的最后顯色是用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3, 3-diaminobenzidinetetra-hydrochloride)，而組織中常含有內源性過氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽性反應和減少背景染色，需要先清除內源性過氧化物酶活性。.具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中2030分鐘.試劑：純甲醇99 ml 30%，H2O21ml 充分混勻，使最后濃度為0.3%，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml 30% H2O2 1ml7PBS洗滌切片經(jīng)甲醇-H2O2或PBS-H2O2 處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min3次。.0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配制：NaH2PO42H2O 0.45 g Na2HPO412H2O 3.23gNaCl 8.0g 蒸餾水加至1000 ml .為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產生非特異性染色，可在PBS中加入Tween20#，制成含0.1% Tween20# 的PBS。 Tween20# 為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。8抗原修復（antigen retrieval, AR）某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長激素(growth hormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質或檢測的因子等于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復或蛋白酶消化。目前機理尚不清楚，但是以高溫、高壓對常規(guī)固定的石蠟切片進行抗原修復處理經(jīng)驗表明，可以提高抗原抗體陽性檢測率，同時也會出現(xiàn)假陽性，現(xiàn)已廣泛用于技術中。尤其對原來僅表達在冰凍切片上的抗原，利用后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。（1）抗原熱修復.方法微波中961020 min直接加熱法10010 min高壓鍋/ 消毒鍋12010 min.其他：水浴鍋10010 min2 及真空加熱10 min 等。.熱修復的介質0.01 mol/L pH 6.0 檸檬酸緩沖液0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 112)0.01 mol/L pH 7.0 PBS2 % 硫酸鋁2 % 硝酸鉛生理鹽水蒸餾水文本框: 溶液的摩爾濃度對修復效果無任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。 溶液的摩爾濃度對修復效果無任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。.溫度與修復時間的關系：許多的實驗結果表明：溫度高修復時間短，如Ki-67和P-gp的檢測，利用同一切片，達到相同染色結果需要：10020min；9030min；8050min；7020h.操作流程微波處理：將切片插入25 片塑料架上，在250 ml塑盒內加入200 ml緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復方法，首先調節(jié)水溫達95左右，將切片置入內含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內，放入水浴鍋，溫度平衡后開始計算時間20 min，取出容器后自然冷卻到室溫。壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內，蓋上鍋蓋，不加閥，開始冒氣計時50 min，關閉氣閥，使之加壓10 min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10 min，冷卻后取出切片，PBS洗。.最佳修復方法的選擇選擇最佳的修復方法設計表檸檬酸Buffer pH 12 pH 6 pH 10-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波10010min2 slide 1 slide 2 slide 3壓力鍋12010min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴9030min slide 7 slide 8 slide 9slide 10 作對照，不作任何處理.抗原熱修復應注意的問題有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應，但石蠟切片用抗原修復后卻能很好顯示，對某些應表達在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復后，絕大部分表達在核內。而有些表達在核內的抗原經(jīng)修復后會出現(xiàn)在胞漿內，因此，在使用該方法時一定要小心，對結果的判定也要做出客觀的分析，同時在操作過程中還注意以下問題：熱處理后應自然冷卻切片。熱處理液不能讓其煮干。不要任何抗原的檢測都使用該方法。一批抗原的檢測其溫度和時間應保持一致。一般經(jīng)高溫修復后胞漿無明顯的破壞，而對細胞核的影響較大，會出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。如果在常用的緩沖液中無法實現(xiàn)抗原修復，得不出好的染色結果，或經(jīng)修復后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等可改變某些抗原的修復。（2）蛋白酶消化法.原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部分結合，提高陽性檢測率。.注意事項：用于IHC消化的酶很多，所選擇酶的種類、使用的濃度、pH值、消化時間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測抗原的性質、組織類型的不同而異，通過預實驗摸索而確定。.常用的消化酶類：胰蛋白酶和蛋白酶K，此兩種酶主要是用于檢測細胞內抗原切片的消化，如Keratin、CEA、GFAP等。另一種是胃蛋白酶，主要是用于細胞間質抗原檢測切片的消化，如纖連蛋白(fibronectin)，各型膠原等。.消化時間及溫度：一般講，消化時間與組織固定的長短呈正比。一般蛋白酶的消化時間51020min，視切片固定時間的長短而定，一般在常溫下進行，也需做預試驗進行對比。（3）酶消化液的配制除了商業(yè)銷售的成品，可按說明書使用外，還可自行配制。0.1% 胰蛋白酶胰蛋白酶0.1g0.1% 氯化鈣(pH 7.8) 100 ml配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用0.1mol/L 的NaOH將其pH調至7.8，然后加入胰蛋白酶0.1g，溶解之。用前將胰蛋白酶液過濾，并在水浴中預熱至37，室溫下消化時間530min，多用于細胞內抗原的暴露。0.4 % 胃蛋白酶胃蛋白酶400 mg0.1N HCl 100 ml多用于間質組織免疫組化染色切片的消化，37下消化時間約30 min。0.06 % 蛋白酶K蛋白酶K 0.06 g0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml用法同上。在免疫組化染色中，有時經(jīng)過度固定的標本，影響一抗與抗原的結合，用蛋白酶溶液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時間應根據(jù)不同組織而異?？傊诒３纸M織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時間延長。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。9. 經(jīng)熱修復抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進行下一步。10. 用與制備二抗相同的動物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。.組織中非抗原抗體反應出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。.最常見的原因是蛋白(第一抗體) 吸附于高電荷的膠原和結締組織成分上。.最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團，而除去與第一抗體的非特異性結合(在室溫下進行)。.非免疫血清的稀釋度1:51:20，還可加入BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含0.16%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。11用特異性一抗孵育切片研究組織細胞中的某種抗原是否存在，應用免疫組化染色，就要選用針對這種抗原的特異性抗體。現(xiàn)在國際上有許多公司生產免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。一抗的種屬來源一抗可來源于各種種屬的動物，常見是來自家兔、山羊或小鼠，偶見來自馬。一般來自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG抗體，而來自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實驗動物或標本種屬的不同，選擇針對大鼠、小鼠或人的抗體?？贵w劑型及滴度檢驗我國現(xiàn)在使用的絕大多數(shù)都是國外進口的試劑，包括一抗和含二抗的試劑盒。.國外生產的一抗一般濃度都是100-200g/ml，但國內各經(jīng)銷商將進口的原裝抗體又進行了分裝，如分成0.1-0.2ml/瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，價格各不相同。.國內各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進口抗體進行稀釋，銷售的品種又分為即用型和濃縮型(進口原裝的抗體)兩種。.在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切片上滴加即可。.濃縮型必須在稀釋后才能使用，因為濃縮型抗體濃度高，可引起嚴重的非特異性染色，因此，必須在正式染色前先用切片對不同滴度的抗體染色效果進行評價，選擇濃度強度最好，非特異性反應（背景染色）最低的抗體稀釋度來進行正式染色。一抗稀釋滴度的評價切片編號slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗體稀釋度1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800特異性染色+ + + + + + + + + + + + + + +背景染色+ + + + + 一抗體的稀釋一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即0.01mol/L PBS pH 7.2-7.4，為進一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應加入制備二抗的同種動物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的濃度在1-2% 即可。一抗的孵育時間及條件加入適當稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37下保溫盒內孵育，在經(jīng)過正常二抗同種動物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時間：30-60分鐘或更長。如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4冰箱內過夜孵育，可達到滿意的效果。12PBS洗滌切片將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應。13用針對一抗的生物素化二抗孵育切片根據(jù)一抗的種屬來源，選擇相應的二抗。如：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用PBS直接以1: 200-400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內孵育30-60min。試劑盒：濃縮型或即用型SP試劑盒、ABC試劑盒試劑盒中包含：內源性過氧化物酶阻斷劑二抗的同種動物非免疫血清生物素標記的抗IgG抗體（二抗）SP試劑或ABC試劑14PBS洗滌切片5min3次15滴加SP試劑或ABC試劑（1）生物素-抗生物素染色（SABC或SP法）的顯色原理.ABC法的染色原理很早以前人們就注意到給動物飼以大量的雞蛋白，會引起明顯的“維生素H 缺乏癥”，也稱為“蛋白質傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68 kD，屬于糖蛋白，當時命名為卵白素（avidin）。機體中還有一種物質叫維生素H，又稱為生物素（biotin），是一種小分子的維生素，廣泛分布于動植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應，分子量為244 D。卵白素具有4個同Vitamin H（生物素）親和力極高的結合點。給動物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結合所致。研究者根據(jù)這兩種物質的特點，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習慣上將維生素H稱為生物素，為便于理解，我國免疫細胞化學作者將卵白素稱為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素-生物素免疫染色法。另外，生物素的另一特點是它可以和抗體IgG的Fc段結合，不影響IgG的活性。同時，生物素經(jīng)活化后還可同過氧化物酶或ALP等結合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反應原理和特性，1981年許世明設計出了免疫組織化學的ABC法（avidin-biotinperoxidasecomplex method，ABC ），并已制成了商品化的試劑盒。ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動物的非免疫血清、生物素標記的二抗外，還包括：A試劑(抗生物素) 和B試劑(生物素-過氧化物酶復合物)。在使用前半小時，將兩種試劑按說明書要求相互混合，形成復合物，一般是在5ml 的PBS中加一滴A試劑(約50l)，混勻后再加一滴B試劑(約50l)，混勻，半小時后加至經(jīng)過生物素標記的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內孵育30-60 分鐘。.SP 法的染色原理基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質素混合液來測定細胞和組織中的抗原。AntigenBiotinylatedsecond antibodyP-OP-OP-OP-OBiotinAvidinHRPPrimary antibodyAvidin-biotin-peroxidase complex文本框: Illustration of ABC methodIllustration of ABC methodBiotinAgAgPrimary antibodyBiotinylatedsecondary antibodySP complex文本框: StreptavidinStreptavidin文本框: Enzyme: HRP or APEnzyme: HRP or AP文本框: Illustration of SP methodIllustration of SP method.SABC 法的染色原理及特點(1) 基本原理鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)物中提取的蛋白質，分子量60kD，不含糖鏈，等電點PI 6.0。與親和素相同也有四個生物素結合點，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結合蛋白。鏈酶親和素同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈酶親和素-生物素-酶復合物。這種復合物中至少存在一個尚未被生物素占據(jù)的親和素結合位點，可以和各種生物素標記的抗體結合。這種復合物即是SABC (strept avidin-biotin complex)。(2) SABC的特點.高敏感性；.低背景；.簡便快速；.結果穩(wěn)定（2）EnVison.系統(tǒng)染色原理.與ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是將二抗與多聚螯合物酶（HRP或AP）通過化學方法連接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更顯著的放大作用，可高出幾十倍。由于多聚物在人或動物體內不存在，因此，無非特異性染色，背景著色極輕。.染色步驟簡便，在一抗反應后，切片經(jīng)PBS洗滌后即可加入EnVison.系統(tǒng)試劑，再經(jīng)PBS洗滌后，可進行顯色。AgAgPrimary antibodySecondary antibody文本框: Enzyme, AP or HRPEnzyme, AP or HRP文本框: Illustration of EnVision methodIllustration of EnVision method16PBS洗滌切片，5 min3。17DAB顯色或AEC顯色，或堿性磷酸酶標記的NBT顯色。（1）DAB顯色液配置DAB 20-50 mg0.01mol/LPBS (pH 7.2-7.4) 100ml或0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.6)30% H2O220-40l配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中5-10-20min，應閉光下反應，并隨時在顯微鏡下觀察結果，隨時終止反應，也可使用商品化的即用型DAB。陽性反應部分為棕色，經(jīng)核復染后，脫水、透明、樹膠封片，但由于有致癌作用，配置時應注意防護。（2）AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) 顯色液AEC 20mg二甲基甲酰胺(DMF) 2.5ml0.05 mol/L 醋酸緩沖液(pH 5.5) 50ml30% H2O25l配置方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻過濾。臨顯色前加入H2O2, 切片顯色時間5-20 min，也可使用商品化的AEC顯色。該顯色液作用后，陽性部分為紅色，如以蘇木素或亮綠復染核后，效果更佳，但終產物溶于酒精和水，故需用甘油封固。（3）堿性磷酸酶（AKP）標記的NBT顯色液預先配置以下試劑：A 液：5% NBT（Nitro-blue-tetrazolium）稱取0.5gNBT溶于10ml 70% 的DMF，充分混合，保存于4，也可分裝成小份，-20保存，用前復至室溫。B 液：5% BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）稱取BCIP 0.5g，溶于10ml DMF內，混勻，4成分裝，保存于-20，用前復至室溫。顯色液：取A 液40l，加入到裝有10ml 的0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 9.5，含0.1mol/LNaCl，5mmol/L MgCl2）管內充分混勻，再加入B液40mol，輕輕混勻即可，最好臨用前就配置，但在顯色液中需加入Levamisole（左旋咪唑）在顯微鏡下隨時觀察顯色反應，陽性結果為藍色或紫色沉淀。上述所提及的各種顯色液目前均有以試劑盒形式出售，只要按說明操作即可，但價格較貴。18. 自來水洗滌切片、核復染、脫水、透明、樹膠封片經(jīng)顯色后，將切片放入自來水中，流水輕沖洗10分鐘，再經(jīng)蒸餾水洗后，放入蘇木素中做核復染（顯色切片）20s-1min，經(jīng)酒精-HCl分化后，在放入自來水中繼續(xù)分化細胞核至滿意為止。經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%、100% 酒精脫水各5min，二甲苯透明后，用樹膠封片。Immunostaining of GFAP and IL-8GFAP, SPGFAP, SPIL-8, ABCIL-8, ABC400400400200ImmunostainingImmunostainingof Fas , Fas L and of Fas , Fas L and CaspasesCaspasesFas, EnVisonFas L, EnVison400400400400Caspase-3, SABCCaspase-6, SABC第三節(jié)免疫組化染色的對照設置在進行免疫組化染色時，必須證實組織內顯示的反應產物，確實是抗原與相應的特異性抗體反應所產生的。由于免疫組織化學染色中影響抗原、抗體和免疫反應的因素很多，因此對免疫組織化學染色結果的評價必須設置對照組才能做出正確的判斷。常用的對照組有以下幾種：一、陽性對照用已證實含用待測抗原的組織，與待檢標本做同樣處理后，進行免疫組化染色，結果應為陽性，稱為陽性對照。每次實驗都應做陽性對照，通過陽性對照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個步驟以及所用的試劑都合乎標準，染色方法可靠。特別是當待檢的標本為陰性結果時，陽性對照呈陽性反應，可排除待檢標本假陽性的可能。所以若預期染色結果是陰性時，就必須設陽性對照。二、陰性對照用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結果為陰性。陰性對照可證實組織內若不含靶抗原，就不應染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應等因素造成的“假陽性”結果。三、空白對照是最常用的對照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結果應為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質引起的非特異性顯色。四、替代對照用與第一抗體來源的同一動物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對照中用非免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進行對照染色。這可證明待檢切片中陽性結果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細胞內待檢抗原的特異性反應的結果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動物的免疫前血清做替代對照，也可用未經(jīng)免疫的同種動物血清，即非免疫血清替代一抗。五、吸收試驗對照用過量已知相應的純化抗原與第一抗體反應，抗體結合點全部被抗原結合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內的抗原反應，故再做免疫組化染色時，結果應為陰性。六、自身對照用同一組織切片上與待檢抗原無關的其它結構做對照。陰性反應與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。但進行科研工作中，單純用這種對照是不科學的。必須增加如空白對照、替代對照等，才能使染色結果得到承認?，F(xiàn)代國際上發(fā)表文章，一般在免疫組化染色的同時，還須有Western blotting做相應蛋白質檢測的實驗結果加以證實。冰凍切片的免疫組織化學染色冰凍切片的免疫組織化學染色也是常用的技術，但一般情況下不用，因為冰凍切片操作較復雜，不易操作，要求標本必須是深低溫快速冷凍，標本不如石蠟塊易保存等，但優(yōu)點是組織的各種抗原保存好。因此一般情況下，只有在應用石蠟切片進行免疫組化染色，包括經(jīng)過抗原熱修復或蛋白酶消化后，仍不能得到陽性染色結果時，才考慮使用冰凍切片染色。第四節(jié)雙重免疫組織化學染色應用免疫組織化學染色方法在同一張組織切片或細胞涂片上同時或先后顯示兩種抗原成分，即為雙重免疫標記。光鏡下通過標記物或其反應生成物的顏色來標記不同的抗原成分，以幫助研究者了解含有這些不同抗原的各類細胞、組織之間的相互關系?？赡苡龅降膯栴}是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)可能與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應，從而造成疊加污染，失去雙重染色的準確性和意義。為避免這種交叉反應，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分為洗脫法和非洗脫法。一、洗脫法1. 基本原理：可選用同種動物產生的特異性抗體（如兔抗X和兔抗Y IgG 抗體）為一抗，另一種動物相應的抗體（如生物素標記的羊抗兔IgG抗體）為二抗，用ABC、SP或SABC方法，或應用EnVison方法進行染色，用不同的酶和底物系統(tǒng)呈色。在完成第一種免疫組化染色后，將抗原抗體復合物洗脫，再做第二種染色。2. 洗脫液：（1）甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.2)：0.1 mol/L鹽酸+0.757%（0.1mol/L）甘氨酸溶液95ml（0.1mol/L的氯化鈉溶液配制）。用該溶液洗切片2h，一般能夠消除第一種染色的抗體系統(tǒng)與下一種染色的交叉反應，但保留顯色反應所得的顏色。（2）高錳酸鉀-硫酸洗脫液：1 ml 2.5% KMnO4，1ml 5% H2S04，加140ml蒸餾水混勻。3. 洗脫法的一般步驟.按常規(guī)做第一種免疫組化染色，可選用HRP為標記物，顯色底物為4-氯萘酚，陽性部位反應產物為藍色。.開始第二種染色前，先將切片經(jīng)蒸餾水洗，再用酸性溶液洗脫。如用pH 2.2的甘氨酸-鹽酸溶液須浸洗2h左右，如用高錳酸鉀-硫酸洗脫液則要5min左右，再將切片移入0.5%的焦亞硫酸鈉（Na2S2O5）水溶液中還原30s，經(jīng)水洗10-20min，蒸餾水洗5min，.按常規(guī)進行下一種免疫組化染色。第二種染色選用DAB為顯色底物，生成物呈棕褐色，與第一種染色中生成的藍色可形成比較鮮明的對比。二、非洗脫法（一）直接法如果采用同一種酶標記在不同的第一抗體上，則只能用順序染色法。即先做第一種染色，用第一種底物與已定位的酶反應呈色，再進行第二種染色。在酶定位于第二種抗原及抗酶系統(tǒng)，而特異性抗體及相應的二抗又是從不同動物產生的，則可將雙重染色的試劑混合在一起應用，節(jié)省染色時間，僅僅在兩種酶與各自的底物反應顯色時按順序進行。（二）標記雙抗原法兩種一抗分別來自不同種動物，二抗分別來自另外兩種不同動物，且標記兩種酶分別作為標記物做雙重染色時，一般第一種染色選用HRP，而在第二種染色中可按需要選擇不同的酶。如選用ALP，還可用不同的底物呈現(xiàn)不同的顏色，如堅固藍呈現(xiàn)的藍色可與DAB的棕色形成良好的對比，堅固紅雖然與DAB的棕色對比相對較差，但也可選用。（三）活性滅活法是一種新建立的方法，主要是根據(jù)通過在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原、抗體和酶活性后再進行第二種染色的原理而設計的。用于滅活的溶液介質一般是檸檬酸緩沖液（pH 6.0），滅活的溫度一般是96左右。本法的優(yōu)點是用于染色的一抗、二抗可分別來自于同一種動物，大大方便了抗體的選擇，只是選用不同的顯色酶和底物。但缺點是所要顯示的第二種抗原必須耐熱。Double Immunostaining of Fas and Fas LDouble Immunostaining of Fas and Fas LEnVisonEnVisonEnVisonEnVison400400400400第五節(jié)細胞凋亡的檢測技術一、凋亡細胞的形態(tài)學改變細胞表面：偽足、微絨毛等消失細胞體形態(tài)：細胞皺縮、變形，體積變小細胞核：染色質濃縮、早期染色質聚集于核膜邊，呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂細胞器：密集但形態(tài)及結構完整，早期內質網(wǎng)短暫擴張細胞膜：完好，晚期包裹細胞器或核碎片，形成凋亡小體在組織中表現(xiàn)：常常以單個細胞散在發(fā)生周圍組織反應：凋亡細胞或小體被鄰近巨噬細胞、上皮細胞吞噬、降解，不發(fā)生炎癥反應發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮、細胞介導的免疫殺傷機制、小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)二、細胞凋亡的形態(tài)學檢測方法（一）凋亡細胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測1制片（1）常規(guī)組織學切片，進行脫蠟和水化。（2）培養(yǎng)細胞可用細胞離心儀制片。由于凋亡細胞在制片中容易破碎，所以應采用低速離心制片（250g，離心5min），并事先將載玻片用1%BSA處理，使細胞易于貼附。離心后涂片，稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4下固定15-30min，然后轉入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20待用。2染色方法可用